الصور المستحثة عبر ربط بروتينات معدلة (PICUP) بالتطبيق على هضميدات Amyloidogenic
Summary
الصورة التي يسببها عبر ربط بروتينات معدلة (PICUP) يسمح توصيف توزيع حجم قليل وحدات البروتين في الخلائط متبدل الاستقرار. علينا أن نظهر لتطبيق PICUP الببتيدات التمثيل الثلاثة amyloidogenic 40 — 42 وبقايا أشكال اميلويد β البروتين ، والكالسيتونين ، والتحكم الببتيد هرمون النمو الافراج عن عامل.
Abstract
تجميع البروتينات amyloidogenic في oligomers السامة هي الحدث البارز في التسبب في أمراض misfolding البروتين ، بما في ذلك مرض الزهايمر ، وباركنسون وأمراض هنتنغتون ، وراثي التصلب الجانبي ، وداء السكري من النوع 2. نظرا لطبيعة هذه التجمعات متبدل الاستقرار البروتين ، فمن الصعب تقدير حجم قليل وحدات توزيعها كميا باستخدام الطرق التقليدية ، مثل الكهربائي ، وتشتت الضوء اللوني ، مضان ، أو حيوية. Oligomers من البروتينات موجودة في الخلائط amyloidogenic متبدل الاستقرار ، الذي فصل في oligomers مونومرات والمنتسبين إلى أكبر التجمعات في نفس الوقت. PICUP استقرار السكان قليل وحدات من خلال لقطات عبر ربط وعند دمجها مع أساليب التجزئة ، مثل الكهربائي سلفات الصوديوم دوديسيل هلام بولي أكريلاميد (SDS – PAGE) أو الحجم الاستبعاد اللوني (SEC) ، ويوفر PICUP التساهمية من حجم التوزيعات التي كانت موجودة قبل قليل وحدات الصليب ربط. وبالتالي ، يمكن تصور PICUP والتحليل الكمي للسكان البروتين متبدل الاستقرار ، ويمكن استخدامها لمراقبة فك التجمع والعلاقات بين التعديلات وتسلسل oligomerization<sup> 1</sup>. ميكانيكيا ، PICUP ينطوي على الصورة للأكسدة من رو<sup> 2 +</sup> في (bipyridyl) تريس المعقدة (II) رو (RuBpy) لرو<sup> 3 +</sup> عن طريق التعرض للأشعة واضحة في وجود المتقبلة الإلكترون. RU<sup> 3 +</sup> قوي واحد الإلكترون مؤكسد قادرة على استخلاص إلكترون من جزيء البروتين المجاورة ، وتوليد البروتين جذرية<sup> 1،2</sup>. الراديكاليين وغير مستقرة ، شديدة التفاعل الأنواع وبالتالي تختفي بسرعة من خلال مجموعة متنوعة من ردود الفعل داخل والجزيئات. ويجوز للاستفادة من راديكالية الطاقة العالية الإلكترون غير مزاوج لتتفاعل مع بروتين آخر مونومر تشكيل جذرية مثنوي ، التي تفقد في وقت لاحق ذرة الهيدروجين وأشكال مستقرة ومرتبطة تساهميا ديمر. قد تتفاعل ثم ديمر مزيد من خلال آلية مماثلة مع مونومرات dimers أو أخرى لتشكيل العليا oligomers. مزايا النسبية PICUP إلى الأساليب الأخرى عبر ربط الصور أو كيميائية<sup> 3،4</sup> تشمل قصيرة (ق ≤ 1) التعرض لغير المدمرة الضوء المرئي ، لا حاجة ل<i> ما قبل الأمر الواقع</i> تعديل التسلسل الأصلي ، وذات طول صفري. التساهمية عبر ربط بالإضافة إلى ذلك ، تمكن PICUP عبر ربط البروتينات داخل درجة الحموضة واسعة وتتراوح درجة الحرارة ، بما في ذلك المعلمات الفسيولوجية. هنا ، علينا أن نظهر لتطبيق PICUP عبر ربط ثلاثة بروتينات amyloidogenic 40 — 42 وبقايا من البروتين اميلويد β المتغيرات (Aβ40 وAβ42) ، والكالسيتونين ، والسيطرة على بروتين ، هرمون النمو الافراج عن عامل (GRF).
Protocol
Discussion
وقد وضعت أصلا لدراسة PICUP مجمعات البروتين مستقرة 2. تم تطبيق الطريقة في وقت لاحق لدراسة كمية بروتين اميلويد متبدل الاستقرار الجمعيات ، بما في ذلك Aβ 10 ، بريون والمرض المرتبط بي ار بي بكالوريوس 11 و 12 α – synuclein. أهم العوامل التي يجب أخذها في الاعتبار عند تصمي?…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق المنح وAG027818 AG030709 من المعاهد الوطنية للصحة / NIA ، 2005/2E من مؤسسة لاري Hillblom L. ، IIRG – 07-58334 من جمعية الزهايمر ، و07-65798 من قسم الصحة العامة في ولاية كاليفورنيا.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chromatography | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
