מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים
Summary
אנו מתארים כיצד למדוד ליד קרום והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי בתרבית בתוך האסטרוציטים באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופיה epifluorescence.
Abstract
המוח מכיל ותאי גלייה. האסטרוציטים, סוג של תא גליה, כבר מזמן ידוע לספק תפקיד תומכת פסיבית נוירונים. עם זאת, הראיות עולה כי הגדלת האסטרוציטים יכולים גם להשתתף באופן פעיל תפקוד המוח דרך אינטראקציות פונקציונלי עם הנוירונים. עם זאת, היבטים בסיסיים רבים של הביולוגיה astrocyte נותרו שנויים במחלוקת, לא ברור ו / או נחקרו בניסוי. נושא אחד חשוב בדינמיקה של הארעיים סידן תאיים ב האסטרוציטים. זה רלוונטי כי סידן הוא הקים גם שליח שנייה חשוב כי זה הוצע כי הגבהים סידן astrocyte יכול לעורר את שחרורו של משדרי של האסטרוציטים. עם זאת, לא היתה כל תיאור מפורט או מספקת של סידן קרום ליד הפלזמה איתות האסטרוציטים. סך הקרינה השתקפות פנימית (TIRF) מיקרוסקופיה הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח אירועים איתות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בתוך כ 100 ננומטר של קרום הפלזמה של תאים חיים. כאן, אנו משתמשים במיקרוסקופ TIRF ולתאר כיצד לפקח ליד הממברנה הפלסמטית והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי כמעט בו זמנית. חידוד נוסף יישום שיטתי של גישה זו יש פוטנציאל להודיע על פרטים מדויקים של איתות סידן astrocyte. הבנה מפורטת של הדינמיקה סידן astrocyte עלול לספק בסיס להבנה אם, איך, מתי ולמה האסטרוציטים ונוירונים לעבור סידן תלויי אינטראקציות תפקודית.
Protocol
Discussion
היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים להציג הגבהים סידן תוך תאי. אלה מתרחשות באופן ספונטני, יכול להיות מופעלות על ידי הפעילות העצבית או על ידי יישום של אגוניסטים כדי להפעיל את הקולטנים על פני השטח astrocyte 11. נושא אחד חשוב במחלוקת היא האם astrocyte הגבהים סידן תוך תאי יכול לעורר את שחרורו…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן הזיכרון Uehara של יפן (כדי ES) וכן קרן וייטהול, המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ ואת פרס שטיין אופנהיימר הקרן (עד BSK).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargille | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | WARNER Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | WARNER Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
- Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
- Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
- Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
- Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).
