החדר דג הזברה המוח Injection
Summary
לאחר היווצרות בצינור העצבי, neuroepithelium מכווץ קפלי תוך הצינור מתמלא הנוזל השדרתי עובריים (eCSF) כדי ליצור את החדרים במוח העוברי. פיתחנו טכניקה זו זריקה החדר כדי להמחיש טוב יותר את החלל מילא נוזל לעומת הצורה neuroepithelial בעובר חי.
Abstract
המוח פרופר החדר היווצרות במהלך התפתחות המוח העוברי נדרש תפקוד המוח הנורמלי. חדרי המוח הינם חללים שמור ביותר בתוך המוח, כי הם מלאות בנוזל השדרה. בשנת דג הזברה, לאחר היווצרות בצינור העצבי, neuroepithelium עובר סדרה של המגבלות וקפלי בזמן שהוא מתמלא נוזל וכתוצאה מכך היווצרות החדר המוח. על מנת להבין את תהליך היווצרות החדר, ואת השינויים בצורת neuroepithelial המתרחשות בעת ובעונה אחת, אנחנו צריכים דרך לחזות את החלל החדר לעומת רקמת המוח. עם זאת, טבעו של עוברי דג הזברה שקוף מקשה להבדיל בין רקמות מחלל החדר. לכן, פיתחנו החדר המוח הזרקת טכניקה שבה שטח החדר מתמלא פלורסנט לצבוע הדמיה על ידי brightfield וכן במיקרוסקופ פלואורסצנטי. Brightfield ותמונות פלורסנט מעובדים אז גבי Photoshop. טכניקה זו מאפשרת להדמיה של מרחב החדר עם צבע פלואורסצנטי, בהשוואה בצורת neuroepithelium בתמונה brightfield. החדר המוח הזרקת דג הזברה יכול להיות מועסק מן ההפריה 18 שעות הודעה דרך שלבים מוקדם הזחל. השתמשנו בטכניקה זו בהרחבה, כמו גם באפיון המורפוגנזה מוח מוטציות (1-3) במחקרים שלנו, של היווצרות המוח החדר ואת המורפוגנזה.
Protocol
Discussion
בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך להזריק צבע פלואורסצנטי (טקסס האדום dextran) לתוך החדרים במוח דג הזברה מתפתח. שיטה זו משמשת כדי להמחיש את המוח בחלל החדר בניגוד neuroepithelium שמסביב שימושי מאוד לקביעת צורה של מרחב החדר, כמו גם את הצורה של רקמת המוח שמסביב. זה מאפשר לנו להבין טוב יות?…
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לאורה Lowery אן שפיתח את הטכניקה הזו במעבדה. HS נתמכת על ידי NIHMH70926. ג'ניפר Gutzman נתמך על ידי מענק CSBi / מרק דוקטורט.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) |
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6 | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | Tip One, US Scientific | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instruments | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , (1995).
