Asidik pH ve Alpha-Expansin İndüklenmiş Ölçüm Bitki Hücre Duvarı Uzantısı (Creep)

Summary

Biz asidik tamponlar ve expansin protein ile indüklenen bitki hücre duvarı örneklerinin uzun vadeli uzantısı (creep) ölçmek için, sabit bir kuvvet ekstensometresinin kullanımını göstermektedir.

Abstract

Büyüyen bitki hücre duvarları, karakteristik bir özellik daha düşük pH ^(<5) 1 genişletilebilir demek olan 'asit büyüme' olarak bilinen sergilerler . Bitki hormonu oksin hızla bir asit-büyüme mekanizması ^{2, 3,} en azından kısmen genç sapları ve benzeri dokuların hücre uzama uyarır . Oksin H aktive ⁺ plazma membran pompası, hücre duvarı çözümü asitlenme neden. Duvar asitlenme hücre duvarı hücre turgor basıncı ile oluşturulan duvar gerilimlere verim neden endojen hücre duvarı gevşemeye proteinler ⁴ expansins etkinleştirir. Sonuç olarak, hücre hızla büyütmek için başlar. Bu 'asit büyüme' fenomen kolaylıkla izole (cansız) hücre duvarı örneklerinin ölçülür. Hücre duvarlarının asitle indüklenen uzantısı geçmesi yeteneği sadece hücre duvarı polisakkaritler (örneğin pektinler) yapısal düzenlemenin sonucu değildir, ancak ⁵ expansins aktivitesine bağlıdır. Expansins bilinen herhangi bir enzimatik aktivitesi yoktur ve expansin aktivite için tahlil etmenin tek yolu, hücre duvarının uzantısı indüksiyon ölçmek için. Bu video raporunun ayrıntıları expansin deneyleri için uygun duvar malzemeleri elde etmek için kaynakları ve hazırlama teknikleri ve asit-indüklenen uzatma ve artan salatalık hypocotyls hazırlanan duvar örneklerinin expansin indüklenen uzantısı göstermeye devam ediyor.

Uygun hücre duvarı örnekleri elde etmek için, salatalık fideleri karanlıkta yetiştirilen, hypocotyls -80 kesilmiş ve donmuş ° C Dondurulmuş hypocotyls, aşınmış, basık, ve sonra sürekli bir gerginlik ekstensometre ölçümleri için özel bir küvete kenetli. Asit kaynaklı uzantısı ölçmek için, duvarlar, başlangıçta yerel hücre duvarlarının bileşenleri expansins düşük aktivite, nötr pH arabelleğe alınır. Asidik pH tampon değişimi üzerine, expansins aktif ve hücre duvarlarının hızla uzanır. Biz aynı zamanda bir sulandırıldıktan tahlil expansin faaliyet göstermektedir. Bu bölümde, biz hücre duvarı örnekleri yerli expansins doğasını kısa bir ısıl işlem kullanın. Bu inaktive edilmiş hücre duvarlarını bile asidik tampon uzatmak yok, ama expansins hücre duvarlarının yanı sıra yeteneklerini genişletmek için hızla geri.

Protocol

Bölüm 1: Büyüyen ve depolama uygun bitki materyali

1. Deneyimlerimize göre, solmuş salatalık fideleri genç hypocotyls hücre duvar malzemesi ile bu deneyler için uygun bir kaynak olarak hizmet vermektedir. Salatalık tohumları, 26 sabit bir sıcaklık odada karanlık bir kabin içinde tutmak bir ışık geçirmez kutu, ° C ıslak kağıt üzerine ekilir C 22 ° ve 30 ° arasında bir şey olarak iyi olmalıdır kesin sıcaklık, kritik değil, ama sıcaklık, fide uygun bir gelişme aşamasına ulaşmak ne kadar hızlı karar verecektir. Sıcak sıcaklık, fide daha hızlı gelişecektir. Genellikle ekim 3-4 gün sonra ulaşılır uzunluğu yaklaşık 5 cm büyüdü fide kullanımı. Işık bile küçük miktarlarda biz bu tekniği ile ölçüm fide gelişimi oranı ve hücre duvarı özelliklerini de etkileyecektir, fide, karanlık yetiştirilen olması çok önemlidir. 3. gün, fide gelişimi kontrol etmek, loş bir yeşil filtrelenmiş ışık kullanarak kutunun içinde gözetleme.
2. Fideler hızla kesilir ve küçük bir plastik kutu, kutu başına 100-150 fide dolu ve -80 ° C'de saklanır. Bu sıcaklık hafta için yararlı kalır.

Bölüm 2: hücre duvarı örneklerinin hazırlanması

1. Dondurulmuş kesilmiş fideler küçük gruplar (8-10), derin dondurucuda -80 dondurucu bloğu içeren bir izolasyonlu konteyner aktarılır.
2. Hipokotil kapsayan manikür carborundum aşınmış. Bu sürekli ıslak carborundum toz kalın bir bulamaç ile kaplı başparmak ve işaret parmağı arasında hipokotil çizerek yapılır. : Çok fazla baskı ve epidermal katman, parçalanmış ve yırtılmış başlar, çok az basınç ve manikür permeabilize olmayacaktır kullanmak doğru basınç miktarını bilmek biraz deneyim alır. Bir de dondurulmuş hipokotil çözülür olarak, onu yönetmek için yumuşak ve sert olur, çünkü hızlı bir şekilde çalışmak zorundadır.
3. Kalan hypocotyls benzer bir şekilde hazırlanan aşınmış hipokotil sonra buzlu su bulunan kalarak carborundum ve en kaldırmak için buzlu suya batırılmış.
4. Hypocotyls istenilen uzunluğa, 1.2 cm genellikle, yeni bir tek kenarlı jiletle kesilmiş ve ardından bir bardak slayt hizalanır.
5. Şimdi hücre özsuyunun kaldırmak ve sıkma kolaylaştırmak için duvarları düzleştirmek için gerekir. Ikinci bir cam slayt, sandviç oluşturan grup 8-10 örneklerinin üstüne yerleştirilir. Ağırlığı (400-500 gr), 5 dakika boyunca cam slayt üst üste yerleştirilir. Ağırlık için rutin olarak uygun bir miktar su içeren bir beher kullanın.
6. İsteğe bağlı adım: deney bağlı olarak, hypocotyls Bu noktada kısa bir ısıl işlem ile inaktive olabilir. Bunu yapmak için, cam, lastik bantlar, bir çift ile birlikte slaytlar bağlayan 100 mL deiyonize su ile oda sıcaklığında bir konteyner montaj ve tam güçte bir mikrodalga fırına yerleştirin. Mikrodalga fırın ile yaklaşık 50 s su kaynamaya başlar ve kaynama başladıktan sonra 15 sn mikrodalga durdurmak. Hızlı sıcak su dökülür ve denatürasyon durdurmak için soğuk su ile değiştirilmelidir. Mikrodalga bizimkinden daha farklı olabilir, bu zamanlamaları değişir olabilir. Aşırı ısıtma ile numunelerin zayıflar ve kolayca kırılabilir. Yetersiz ısıtma ile endojen expansin inaktive ve duvar örnekleri asidik pH yanıt korumak değildir.

Bölüm 3: Ekstensometre kurulum

1. Duvar örnekleri artık sabit bir kuvvet ekstensometre kenetlenir. Bu duvar örnek ve örnek apikal sonuna kadar bağlı bir hareketli kelepçe bazal ucunu tutmak için bir pleksiglas küvet oluşan bir özel yapılmış bir cihazdır. Hareketli kelepçe açık bir pozisyon sensörü bobinler üzerinden geçen bir çubuk üzerine monte edilmiş, bir LVDT ya da elektronik bir küçük metal silindirin pozisyonunu algılar 'Doğrusal Değişken Diferansiyel Trafo', veya 'çekirdek' olduğunu çubuk bağlı. Ayarlanabilir bir karşı ağırlık ile çubuğun üst ucu bir kolu bağlıdır. Bu kolu duvar örnek üzerinde ayarlanabilir bir miktar yukarı yönlü kuvvet uygular. Kuvvet kolu ucunda kalibre metal ağırlıklar ekleyerek veya kaldırarak ayarlanır.
2. Duvar örnek hipokotil örnek bazal ince forseps ve apikal sonu ~ 2-3 mm hareketli kelepçe açık çeneleri arasına yerleştirilir ile alınır. Bu kelepçe, metal çeneleri metal yüzeyi ve tampon çözelti veya duvar numune arasında doğrudan temasını önlemek için plastik ile kaplanmış, bir yaylı timsah kelepçe. Deneyimimiz metal iyonları, genişletmek ve bu yüzden metal kaplı tutmak için duvar yeteneğini inhibe kelepçe ile liç ve.
3. Holding, bir yandan hareketli kelepçe montaj duvar örnek bazal sonuna Pleksiglas küvet ve küvet iki menteşeli adet arasında manevra.parçaları bir araya getirdi ve böylece küvet duvar örnek alt ucunda kilitleme, sıkı vidalanmış.
4. Hareketli kelepçe montaj hafifçe karşı ağırlık tam güç duvar örneği aktarılacak izin yayınladı. Biz rutin olarak toplam 20 gr salatalık hypocotyls hazırlanan duvar örnekleri için bir karşı ağırlık kullanın. Diğer duvar malzeme veya deneyler farklı ağırlıklar gerektirebilir.
5. Küvet tamponu ile dolduruldu (200 uL) ve küvet pozisyonu bir ayar vidası ile hareketli kelepçe LVDT ölçüm aralığı alt ucuna getirilir ki, aşağı yukarı taşınmış veya. Bizim LVDT bir mikrobilgisayar bir veri toplama ünitesine bağlı ve bu yüzden bilgisayar aracılığıyla LVDT pozisyonunu izlemek. Biz, bize aynı anda 8 duvar numunelerinin çalışılabilmesi için sağlayan bir bilgisayar ile paralel bağlı sekiz LVDT meclisleri var. Bilgisayar her 30 saniye sonra LVDT meclislerinin her pozisyonda kayıtları

Bölüm 4: pH veya expansin Ölçüm uzantısı yanıt Temsilcisi Sonuçlar

1. [Birinci Deney] asitle indüklenen uzantısı ölçümü için, yerli duvar örnekleri (yani ısı ile inaktive değildir) ve tarafsız bir tampon ile başlar küvet eklenir. Duvar örnekleri eklendi gerilime tepki olarak, birkaç dakika için, genişletmek, ancak uzatma bozunur birkaç dakika sonra düşük bir oran. Bizim bilgisayar bize ya örnek uzunluğu değişimi (Deney başladıktan sonra, hareketli kelepçe pozisyon değişikliği,) monitör ya da başka bir deyişle, uzatma oranı pozisyon türevi izleyebilirsiniz sağlar . Uzantısı oranı düşük bir değere zamanla dengeler.
2. ~ 20 dakika sonra, tarafsız bir tampon kaldırılır. Biz büyük bir göstergesi derialtı iğne yapılmış, duvar minimal rahatsızlık veya mekanik montaj, hızlı bir tampon kaldırmak için bir vakum pompası bağlı ince bir metal boru kullanırlar. Asidik tampon sonra asidik tampon tam döviz sigortalamak için 1-2 hızlı değişim, bazen eklenir. Sonra arkanıza yaslanın ve duvar yanıt izlemek. Tipik olarak bir kaç dakika içinde uzantısı daha hızlı tespit edebilir. Ölçümler bazı durumlarda daha uzun süre uzatabilir rağmen biz genellikle 60 dakika sonra, uzatma yanıtı değerlendirmek için yeterli bilgiye sahip.
3. [İkinci Experiment] expansin indüklenen hücre duvarının uzantısı ölçümü için, ısı ile inaktive edilmiş duvar örnekleri ve asidik tampon ile başlar, küvet eklenir . İlk Deneyim olduğu gibi, hücre duvarı uzantısı oranı giderek fonksiyonel expansin eksikliği nedeniyle düşük bir değere stabilize.
4. ~ 20 dakika sonra, expansin protein, küvet tamponu ile bir expansin çözüm 10-20 uL 'spike' küvet eklenir. Expansin hücre duvarı örnek hızla nüfuz eder ve birkaç dakika içinde uzantısı oranının arttığını görüyoruz. Bu uzantı, bir saat veya daha fazla yanıt takip edilebilir.

Şekil 1: asit-indüklenen veya expansin indüklenen duvar uzantısı değerlendirmek için hücre duvarlarının hazırlamak için prosedürlerin Anahat.

Discussion

Bu gösteri için, ele almak ve iyi bir duyarlılık ile tepki verdiği için kolay duvar örneklerinin güvenilir bir kaynak olduğunu kanıtladı, çünkü biz salatalık hypocotyls hücre duvarlarının kullandı. Ayrıca, genç ıspanak yaprakları ve kereviz sapı gibi süpermarket diğer fide gibi bazı malzemeler, duvarları ile iyi bir başarı oldu. Temel olarak, genç, yumuşak, hızla büyüyen bitki dokularında, bu teknik ile kolayca ölçülebilir olması muhtemeldir, ama sağlam, eski, okside veya nongrowing bitki dokularında hücre duvar çapraz bağlantı nedeniyle duyarlı olması muhtemel. , Dikkat edilmesi gereken bir kaç başka şeyler vardır:

1. Biyolojik çeşitlilik - üniform fideler bile değişken tepkiler verir, bu yüzden en az 5-8 çoğaltır istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar vermesi için gerekli.
2. Kütikül aşınması, tamponlar ve proteinlerin hücre duvarı numunesi içine hızlı nüfuz izin önemlidir. Manikür yeterince aşınmış değilse, asidik tamponlar verilen yanıtlar yavaş ve sessiz olacaktır ve proteinlerin bile bir yanıt ortaya çıkarmak için manikür nüfuz olmayabilir. Epidermal peeling ya da diğer disseke dokuların kullanıyorsanız bazı örnekler aşınma, yani gerek olmayabilir. Birörnek aşınma birçok yeni başlayanlar için önemli bir değişkenlik ekler.
3. Isı inaktivasyonu, endojen expansins doğasını veya kaldırmak için kullanılır, diğer yöntemlerle yürütülen olabilir, ama bir ihtiyacı duvar örnekleri aşırı zayıflaması ve kırılmaları önlemek için endojen expansin inaktive etmek için ısıtma az miktarda bulmak için.
4. Expansins oksidasyon tarafından inaktivasyonu eğilimli, tampon 1-5 mM dithiothreitol genellikle aktivite stabilize etmek için yardımcı olur.
5. Ekstensometre ekipman bir off-the-raf parçası değildir, ancak (a) duvar örnek ve (b) LVDT kelepçe karşı ağırlık montaj tutan küvet özel inşaat gerektirir. Bilgisayar arayüzü ve veri toplama ünitesi gerekli değildir, ama, çoğaltmak örnekleri aynı anda çalıştırmak için ve kantitatif uzantısı eğrileri analiz için özellikle değerlidir.