Изоляция человека Островок поджелудочной железы: Часть II: Очистка и культуры прав Островки
Summary
Достижение высокого качества и соответствующего количества человеческих островков является одним из видных предпосылки для успешной трансплантации островок. В этом видео мы опишем шаг за шагом процедуры человеческой изоляции островков поджелудочной железы (часть II: очищение и культуре человеческих островков) с помощью модифицированного метода автоматизированного.
Abstract
Управление диабетом 1 типа является обременительной, как для личности и общества, стоимостью более 100 миллиардов долларов в год. Несмотря на широкое использование мониторинга уровня глюкозы и новые формулировки инсулина, многие люди по-прежнему развиваться разрушительных вторичных осложнений. Трансплантация островков поджелудочной железы может восстановить около нормы контроля уровня глюкозы у больных сахарным диабетом<sup> 1</sup>, Без риска серьезных эпизодов гипогликемии, которые связаны с интенсивной инсулинотерапии. Обеспечение достаточной массы островок имеет важное значение для успешной трансплантации островок. Тем не менее, доноры характеристик, обеспечения органами и сохранение влияют изоляции результат<sup> 2</sup>. В Университете Иллинойса в Чикаго (UIC) мы разработали успешную протокол изоляции с улучшенной градиент очистки<sup> 3</sup>. Программа началась в январе 2004 года и более 300 выделений проводились до ноября 2008 года. Pancreata были отправлены в холодной решения сохранение (ВУ, Университет Висконсин или НТК, гистидин-триптофан кетоглутарат)<sup> 4-7</sup> Для лабораторных клеточных изоляции в МСЖД для изоляции островок. Панкреатических островков были изолированы с помощью МСЖД метод, который представляет собой модифицированный вариант метода первоначально описывается Ricordi<em> И др.</em><sup> 8</sup>. Как описано в первой части: Пищеварение и сбор ткани поджелудочной железы, поджелудочной железы человека была подстрижена, канюлированные, перфузию, и переваривается. После сбора и не менее 30 минут инкубации в растворе UW, ткань была загружена в сепаратор клеток (COBE 2991, COBE, Лейквуд, CO) для очистки<sup> 3</sup>. После очистки, островок доходности (в виде островка эквиваленты, IEQ), объем ткани, и чистота была определена в соответствии со стандартными методами<sup> 9</sup>. Изолированные островки культивируют в CMRL-1066 средств массовой информации (Mediatech, Херндон, В. А.) с добавлением 1,5% человеческого альбумина, 0,1% инсулин-трансферрин-селен (ИТС), 1 мл ципрофлоксацин, 5 мл 1 М HEPES, и 14,5 мл 7,5% бикарбоната натрия в T175 колбах при температуре 37 ° С в течение ночи культуры до островков были пересажены или использоваться для исследований.
Protocol
Discussion
Несмотря на значительные достижения в области техники человеческой изоляции островок, островок доходность остается очень изменчива и непредсказуема. Очистка переваривается ткани поджелудочной железы имеет решающее значение для восстановления достаточную массу остров после успешн…
Acknowledgements
Поддерживаемые основав из университета Иллинойса в Чикаго, а также островковых клеток ресурсный центр NIH грант (RFA-RR 05-003), Кристофер Фонда Efroymson Фонда, а Фонд Tellabs.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech Inc | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
