Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel II: Zuivering en cultuur van de mens Eilandjes
Summary
Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel II: zuivering en cultuur van de menselijke eilandjes) met behulp van een aangepaste automatische methode.
Abstract
Het beheer van type 1 diabetes is belastend, zowel voor het individu en de samenleving, voor meer dan 100 miljard dollar per jaar. Ondanks het wijdverbreide gebruik van glucose monitoring en nieuwe insuline-formuleringen, veel mensen nog steeds te ontwikkelen verwoestende secundaire complicaties. Eilandjes van Langerhans transplantatie kan herstellen in de buurt van normale glucose-controle bij patiënten met diabetes<sup> 1</sup>, Zonder het risico van ernstige hypoglycemische episodes die geassocieerd worden met intensieve insulinetherapie. Zorgen voor voldoende eilandje massa is van belang voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. Echter, donor kenmerken, orgaanverkrijging en het behoud van invloed op de uitkomst isolatie<sup> 2</sup>. Aan de Universiteit van Illinois in Chicago (UIC) ontwikkelden we een succesvolle isolatie protocol met een verbeterde zuivering gradiënt<sup> 3</sup>. Het programma is gestart in januari 2004 en meer dan 300 isolaties werden uitgevoerd tot en met november 2008. De pancreata werden in koude behoud oplossingen (UW, Universiteit van Wisconsin-of HTK, Histidine-tryptofaan Ketoglutaraat)<sup> 4-7</sup> Om de Cell Isolatie Laboratory van UIC voor eilandje isolatie. Pancreaseilandjes werden geïsoleerd met behulp van de UIC-methode, die is een gewijzigde versie van de methode die oorspronkelijk beschreven door Ricordi<em> Et al.</em><sup> 8</sup>. Zoals beschreven in deel I: Spijsvertering en verzamelen van alvleesklierweefsel, was de menselijke pancreas getrimd, gecanuleerde, doorbloed, en verteerd. Na het verzamelen en ten minste 30 minuten incubatie in UW oplossing, was het weefsel dat in de cel scheidingsteken (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) voor de zuivering<sup> 3</sup>. Na de zuivering, eilandje rendement (uitgedrukt in eilandje-equivalenten, IEQ), weefsel volume en zuiverheid werd bepaald volgens standaardmethoden<sup> 9</sup>. Geïsoleerde eilandjes werden gekweekt in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), aangevuld met 1,5% humaan albumine, 0,1% insuline-transferrine-selenium (ITS), 1 ml van Ciprofloxacine, 5 ml 1M HEPES, en 14,5 ml van de 7,5% natriumbicarbonaat in T175 kolven bij 37 ° C gedurende de nacht cultuur voordat eilandjes getransplanteerd werden of worden gebruikt voor onderzoek.
Protocol
Discussion
Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in de technieken van de menselijke eilandje isolatie, eilandje opbrengst blijven zeer variabel en onvoorspelbaar. Zuivering van verteerd pancreas weefsel is van cruciaal belang om voldoende massa eiland te herstellen na de succesvolle enzymatische vertering voor transplantatie. De UIC zuiveringsmethode is aanbevolen omdat een superieur herstel van zeer zuivere menselijke eilandjes werd aangetoond met behulp van deze methode. Bovendien kan tot 50 ml van verteerd weefsel worden geladen …
Acknowledgements
Ondersteund door de oprichting van de Universiteit van Illinois in Chicago als Islet Cell Resource Center NIH-subsidie (RFA-RR 05-003), de Christopher Foundation, de Efroymson Foundation, en de Tellabs Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech Inc | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
