הלבלב האנושי בידוד איילט: חלק ב: טיהור והתרבות של איי האדם
Summary
השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון הלבלב האנושי (חלק II: טיהור והתרבות של איים אדם) באמצעות שיטה אוטומטית שונה.
Abstract
ניהול של סוכרת מסוג 1 היא מעיקה, הן הפרט והחברה, עולה מעל 100 מיליארד דולר בשנה. למרות השימוש הנרחב של ניטור גלוקוז אינסולין ניסוחים חדשים, אנשים רבים עדיין לפתח סיבוכים משניים הרסנית. איון השתלת הלבלב יכול לשחזר ליד בקרת גלוקוז נורמלי אצל חולי סוכרת<sup> 1</sup>, בלי הסיכון של התקפי היפוגליקמיה חמורים הקשורים בטיפול אינטנסיבי באינסולין. מתן המוני איון מספיק חשוב איון השתלה מוצלחת. עם זאת, תכונות התורם, רכש איברים ושימור להשפיע על התוצאה בידוד<sup> 2</sup>. באוניברסיטת אילינוי בשיקגו (UIC) פיתחנו פרוטוקול בידוד מוצלח עם שיפוע טיהור משופרת<sup> 3</sup>. התוכנית החלה בחודש ינואר 2004 יותר מ -300 isolations בוצעו עד נובמבר 2008. Pancreata נשלחו בקור פתרונות שימור (UW, אוניברסיטת ויסקונסין או HTK, היסטידין-טריפטופן Ketoglutarate)<sup> 4-7</sup> אל המעבדה תא בידוד בבית UIC לבידוד איון. איי הלבלב בודדו בשיטת UIC, שהיא גירסה שונה של השיטה המתוארת במקור על ידי Ricordi<em> ואח'</em><sup> 8</sup>. כפי שתואר חלק א: העיכול אוסף של רקמות הלבלב, הלבלב האנושי היה מטופח, cannulated, perfused ו מעוכל. לאחר איסוף לפחות 30 דקות של הדגרה בתמיסה UW, הרקמה היה טעון מפריד תאים (COBE 2991, Cobe, לייקווד, CO) לטיהור<sup> 3</sup>. לאחר טיהור, תשואה איון (כפי שבאה לידי ביטוי ושווי איון, IEQ), נפח הרקמה, וטוהר נקבע על פי שיטות סטנדרטיות<sup> 9</sup>. איים מבודדים היו בתרבית CMRL-1066 מדיה (Mediatech, הרנדון, VA), בתוספת 1.5% אלבומין אנושי, 0.1% אינסולין transferrin, סלניום (ITS), 1 מ"ל של ציפרופלוקסאצין, 5 מ"ל של HEPES 1M, ו 14.5 מ"ל 7.5% סודיום ביקרבונט ב T175 צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס תרבות לילה לפני איים הושתלו או משמש למחקר.
Protocol
Discussion
למרות התקדמות משמעותית בשיטות של בידוד איון אדם, תשואה איון להישאר משתנה מאוד ובלתי צפוי. טיהור של רקמת לבלב מתעכל הוא חיוני כדי להתאושש מסה האי מספיק לאחר עיכול אנזימטי מוצלח להשתלה. שיטת טיהור UIC מומלץ כי התאוששות מעולה של איים אדם טהור מאוד הודגם באמצעות שיטה זו. ית…
Acknowledgements
נתמך על ידי המייסדים מאוניברסיטת אילינוי בשיקגו, כמו גם משאבים איילט Cell מרכז NIH מענק (RFA-RR 05-003), קרן כריסטופר, קרן Efroymson, וקרן Tellabs.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter | 424803 | |
| Cobe 2991 Cell Processor | equipment | Gambro. BCT | 2556 | islet purification |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Diagnostic Instrument Co | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nunc Brand Products | 174926 | islet counting |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon | 217267 | |
| COBE bag | disposable equipment | O.R. Solution | 66707003 | |
| T175 culture flask | disposable equipment | Sarstedt | 83.1812.500 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech Inc | 99-597-CM | |
| Ficoll 1.100 | reagent | Bichrom AG | L6155 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech Inc | 99-784-CM | |
| Final wash/Culture Medium | reagent | Mediatech Inc | 99-785-CV | |
| Dithizone | reagent | Sigma | D5130 |
References
- Shapiro, A. M. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).
- Ricordi, C. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).
