جيل من الخلايا البشرية باء تنشيط CD40

Summary

في هذا الفيديو نقدم<em> خارج الحي</em> توليد والتوسع في خلايا B – CD40 تنشيط (CD40 – B) من خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMC) عن طريق التحفيز مع CD40 يجند وانترلوكين 4.

Abstract

وقد تم تحديد CD40 تنشيط خلايا B (CD40 – B الخلايا) كمصدر بديل للالمناعية تنشيطية مستضد تقديم الخلايا ، ^1-3 (APC) لعلاج مناعي السرطان. بالمقارنة مع الخلايا الجذعية (DCS) ، وأفضل APC تتسم ، CD40 – B وخلايا عدة متميزة الخصائص البيولوجية والتقنية. مماثلة للبلدان النامية ، تظهر الخلايا B تعبير زيادة MHC وشارك في تنشيطية جزيئات (Fig.1b) ، المعرض قدرة قوية المهاجرة وتقديم العرض مستضد بكفاءة إلى خلايا T ، بعد التحفيز مع يجند انترلوكين 4 و CD40 (CD40L). لكن ، على النقيض من البلدان النامية غير ناضجة أو ناضجة ، CD40 – B الخلايا التعبير عن العقدة الليمفاوية ثالوث صاروخ موجه كامل يتكون من CD62L ، CCR7/CXCR4 وظيفة الكريات البيض مستضد – 1 (LFA1 ، CD11a/CD18) ، اللازمة لصاروخ موجه إلى الأجهزة اللمفاوية الثانوية (Fig.1a) ^3. يمكن أن تتولد CD40 – B الخلايا دون صعوبات من كميات صغيرة جدا من الدم المحيطي التي يمكن مزيد من التوسع في المختبر لكميات كبيرة جدا من درجة عالية من محض CD40 – B الخلايا السرطانية (> 10 ⁹ خلايا لكل مريض) من المتبرعين الأصحاء وكذلك مرضى (Fig.1c ، د) ^1،4.

في هذا البروتوكول ونحن لشرح كيفية الحصول على تفعيلها بشكل كامل CD40 – B الخلايا من PBMC الإنسان. الجزيئات الأساسية للثقافة الخلية هي CD40 يجند ، انترلوكين 4 (IL – 4) ، والسيكلوسبورين A (CSA) ، والتي تتجدد في حلقة اليوم ثقافة 3-4 لأغراض المختبر قدمت CD40 – تحفيز الخلايا التي NIH/3T3 معربا عن المؤتلف الإنسان CD40 يجند (tCD40L NIH/3T3) ^5. لتجنب التلوث مع المنظمات غير transfected الخلايا ، والتعبير ليجند CD40 الإنسان على transfectants يجب أن يكون محددا بشكل منتظم (Fig.2).

بعد 14 يوما CD40 B – الثقافات الخلية تتكون من خلايا أكثر من 95 ٪ ب نقية وتوسيع CD40 – B الخلايا أكثر من 65 يوما هو ممكن في كثير من الأحيان من دون أي خسارة وظيفة ^{1 و 4.} CD40 – B الخلايا تأخذ بكفاءة أعلى ، و ⁶ مولدات المضادات العملية الحالية لخلايا تي. انهم لا naϊve فقط الوزراء ، وإنما أيضا توسيع الخلايا التائية الذاكرة ^7،8. ويمكن استخدام CD40 تنشيط خلايا B لدراسة الخلية B – التنشيط ، والتمايز وظيفة. وعلاوة على ذلك ، لأنها تمثل أداة واعدة للقاح علاجي أو وقائي ضد الأورام ^9.

Protocol

وينقسم البروتوكول لتوليد خلايا B التي تنشط من CD40 PBMC إلى جزأين : الجزء A يدل على إعداد CD40 يجند NIH/3T3 معربا عن الخلايا ، والتي سوف تستخدم في الخلايا المغذية لوحة محدد. الجزء باء يصف الفعلية CD40 – B الثقافة. A. إعداد الخلايا المغذية (tCD40L NIH/3T3) …

Materials

A. Preparation of Media:

Feeder cell wild type medium		Feeder cell selection medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
DMEM-Ham’s / F12		DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine	365 μg/mL	L-Glutamine	365 μg/mL
FBS	10 %	FBS	10 %
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		G-418	0.7 mg/mL

CD40-B washing medium		CD40-B culture medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
IMDM		IMDM
L-Glutamine	584 μg/mL	L-Glutamine	584 μg/mL
HEPES	25 mM	HEPES	25 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		rh Transferrin	50 μg/mL
		rh Insulin	5 μg/mL
		AB-Humanserum	10 %

B. Miscellaneous Reagents:

Reagent	Company	Order No
DMEM / Ham’s F12	PAA	Cat No: E15-813
IMDM	Invitrogen Gibco®	REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x)	PAA	Cat No H15-011
AB-Human Serum	Invitrogen	Cat No 34005100
holo-Transferrin human	Sigma	Cat No T0665
Insulin human	Sigma	Cat No I2643
Gencin®	Delta Select	Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4	Immunotools	Cat No 11130045
Cyclosporin A	Novartis	Cat No NDC 0078-0109-01
FBS	LONZA	Cat No DE14-802C
HEPES Buffer	PAA	Cat No S11-001
G-418 Sulphate	PAA	Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x)	Invitrogen Gibco®	REF 15400-054

C. Miscellaneous Supplies:

Reagent	Company	Order No
Sterile pipette tips	Sarstedt
6-well plate	NUNC	Cat No 140675
50mL conical tube	BD Falcon™	Cat No 352070
Tissue culture flask	SARSTEDT	Cat No 83.1813.002