Bu video mevcut<em> Ex vivo</em> Insan CD40 aktive B hücreleri, CD40 ligand ve interlökin-4 ile stimülasyon periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) üretimi ve genişleme (CD40-B).
CD40-aktive B hücreleri (CD40-B hücreleri) immüno-uyarıcı antijen sunan hücreler (APC), kanser immünoterapi için 1-3 alternatif bir kaynak olarak tespit edilmiştir . CD40-B hücreleri birkaç farklı biyolojik ve teknik özellikleri Dendritik hücreler (DH), en iyi karakterize APC ile karşılaştırıldığında. DC'ler benzer şekilde, B hücreleri MHC ve co-uyarıcı moleküller (Fig.1b) artmış ekspresyonu, interlökin-4 ve CD40 ligand (CD40L) ile stimülasyon sonra, güçlü bir göçmen kapasite ve mevcut antijen sunumu T hücrelerinin verimli sergilerler. Ancak, olgunlaşmamış ya da olgun DC'ler aksine, CD40-B hücreleri CD62L, CCR7/CXCR4 oluşan tam bir lenf nodu homing üçlüsü ifade ve ikincil lenfoid organlara homing gerekli lökosit fonksiyon antijen-1 (LFA1, CD11a/CD18) (Fig.1a) 3 CD40-B hücreleri, periferik kanda çok az miktarda daha yüksek saf CD40 B hücreleri sağlıklı donörlerden (> 10 9 hasta başına hücreleri) yanı sıra kanser çok büyük miktarda in vitro açılabilir zorluklar olmadan oluşturulabilir hasta (Fig.1c d) 1,4.
Bu protokol, insan hücre tamamen aktif CD40-B hücreleri nasıl elde göstermektedir. Hücre kültürü için anahtar moleküller CD40 ligand, interlökin-4 (IL-4) ve siklosporin A (CsA), 3-4 günde bir kültür döngüsü yenileniyor. Laboratuvar amaçları için CD40 stimülasyon, rekombinant insan CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5 ifade NIH/3T3 hücreleri tarafından sağlanmaktadır . -Transfekte olmayan hücreleri ile kirlenmesini önlemek için, transfektanları insan CD40 ligand ekspresyonu (Şekil 2) düzenli olarak kontrol edilmelidir.
14 gün sonra CD40 B hücre kültürleri fazla% 95 saf B hücreleri CD40-B hücreleri ve 65 gün içinde bir genişleme sık fonksiyonu 1, 4 herhangi bir kayıp olmaksızın mümkün oluşur. CD40-B hücreleri verimli, süreç kadar sürebilir ve T hücrelerinin mevcut antijenler 6. Sadece başbakan naϊve değil, aynı zamanda bellek T hücreleri 7,8 genişletmek. CD40 ile aktive olan B hücreleri, B-hücre aktivasyonu, farklılaşma ve fonksiyon çalışma için kullanılabilir. Ayrıca, tümörler 9 karşı tedavi veya önleyici aşı için umut verici bir aracı temsil eder.
A. Preparation of Media:
Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
DMEM-Ham’s / F12 | DMEM-Ham’s / F12 | ||
L-Glutamine | 365 μg/mL | L-Glutamine | 365 μg/mL |
FBS | 10 % | FBS | 10 % |
HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
G-418 | 0.7 mg/mL |
CD40-B washing medium | CD40-B culture medium | ||
Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
IMDM | |
IMDM | |
L-Glutamine | 584 μg/mL | L-Glutamine | 584 μg/mL |
HEPES | 25 mM | HEPES | 25 mM |
Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
rh Transferrin | 50 μg/mL | ||
rh Insulin | 5 μg/mL | ||
AB-Humanserum | 10 % |
B. Miscellaneous Reagents:
Reagent | Company | Order No |
DMEM / Ham’s F12 | PAA | Cat No: E15-813 |
IMDM | Invitrogen Gibco® | REF 21980-032 |
Dulbecco’s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
AB-Human Serum | Invitrogen | Cat No 34005100 |
holo-Transferrin human | Sigma | Cat No T0665 |
Insulin human | Sigma | Cat No I2643 |
Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
Recombinant Human Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 11130045 |
Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
G-418 Sulphate | PAA | Cat No P02-012 |
Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
Reagent | Company | Order No |
Sterile pipette tips | Sarstedt | |
6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
Tissue culture flask | SARSTEDT | Cat No 83.1813.002 |