الحصول على عالي النقاء المقوسة الغوندية البيضات من قبل التدرج كلوريد السيزيوم متقطع

Summary

توضح هذه الدراسة في تطوير أسلوب CSCL المحورة التي تنقي بسهولة T. البيضات الغوندية من براز القطط المصابة التي هي مناسبة لوالأنسجة البيولوجية الجزيئية التلاعب الثقافة

Abstract

المقوسة الغوندية هو إلزام الممرض الذي يصيب الخلايا الأوالي عادة البشر. وهو يتميز أيضا apicomplexan المرتبطة تسبب تفشي الأمراض الغذائية والأمراض التي تنقلها المياه. المضيف النهائي هو النوع الماكر حيث تكرار الجنسي مما أدى إلى حدوث تطور البيضة المتكيسة شديد العدوى ومقاوم للبيئة. تحدث العدوى عن طريق ابتلاع الخراجات الأنسجة من اللحوم الملوثة أو البيضات من التربة أو الماء. العدوى غير متناظرة عادة في الاشخاص الاصحاء ، ولكن النتائج في العدوى الكامنة مدى الحياة التي يمكن أن تسبب التهاب الدماغ بالمقوسات تنشيط والموت إذا كان الفرد يصبح المناعة لحوم ملوثة T. وقد الخراجات الغوندية المصدر الرئيسي للعدوى في أوروبا والولايات المتحدة ، ولكن التغيرات التي حدثت مؤخرا في إدارة تربية الحيوان والممارسات وتحسين مناولة الأغذية وإجراءات التجهيز قد خفضت بشكل كبير من انتشار T. الخراجات الغوندية في اللحوم ^{1 و 2.} ومع ذلك ، فإن الانتشار المصلي في البشر لا تزال مرتفعة نسبيا مما يوحي بأن التعرض البيضة المتكيسة من التربة أو الماء الملوث هو المرجح. في الواقع ، تم التبليغ عن فاشيات من داء المقوسات التي تنقلها المياه في جميع أنحاء العالم تدعم نظرية التعرض لشكل البيضة المتكيسة البيئية يشكل مخاطر صحية كبيرة ^3-5. للبحث ، على فهم تاريخ انتشار T. وتقتصر البيضات الغوندية في الماء والبيئة نظرا لعدم وجود أدوات للكشف عن البيضات في البيئة ^{5 ، 6.} هذا يرجع أساسا إلى عدم وجود بروتوكولات تنقية فعالة للحصول على أعداد كبيرة من تخصيبه بدرجة T البيضات الغوندية من القطط المصابة لأغراض بحثية. توضح هذه الدراسة في تطوير أسلوب CSCL المحورة التي تنقي بسهولة T. البيضات الغوندية من براز القطط المصابة التي هي مناسبة لوالأنسجة البيولوجية الجزيئية التلاعب الثقافة ^7.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. احتياطات السلامة العامة عند العمل مع<em> T. الغوندية</em> البيضات</p><ol><li> من المهم متابعة جميع احتياطات السلامة عند العمل مع<em> T. الغوندية</em> البيضات. في الأفراد الأكثر صحية ،<em> T. الغوندية</emوتسيطر بسهولة> العدوى عن طريق الجهاز المناعي ، ولكن على نتائج الإصابة مدى الحياة. الأفراد المناعة معرضون بشكل خاص لمعالجة داء المقوسات ، وينبغي أن لا<em> T. الغوندية</em> البيضات. وينبغي أن النساء الحوامل كما يتم معالجة<em> T. الغوندية</em> البيضات ، لأن العدوى يمكن أن يسبب تشوهات خلقية شديدة⁸.</li><li<em> T. الغوندية</emيجب فقط> البيضات يتم التعامل معها في مجال معين ومع الموظفين المدربين. علامات تشير إلى<em> T. الغوندية</emيجب نشر> البيضة المتكيسة العمل جار لتنبيه الآخرين دخول المنطقة المعينة.</li><li> ملابس مناسبة معدات الحماية الشخصية (PPE) مثل معطف المختبر ، ثوب القابل للتصرف ، والقفازات القابل للتصرف ، والمناسبة لحماية العين أو درع الوجه عند التعامل مع<em> T. الغوندية</em> البيضات.</li><liويوصى> قفاز التغييرات المتكررة. لا تتعامل مع أي معدات مختبر مع<em> T. الغوندية</em> البيضة المتكيسة الملوثة قفازات.</li><li> دوما استخدام الصواني المعدنية autoclavable اصطف مع المتشددين a ماصة للتصرف عند العمل مع<em> T. الغوندية</em> البيضات. التأكد من أن كل الرفوف ، والأنابيب وغيرها المستخدمة هي القابل للتصرف أو autoclavable.</li><li> جميع<em> T. الغوندية</emيجب تعقيمها> النفايات مرتين لمدة ساعة على الأقل.</li><li> يجب عليك أيضا جميع المعدات غير القابل للتصرف (الرفوف ، والصواني ، وغيرها) يمكن تعقيمها مرتين لمدة ساعة على الأقل.</li><liيجب أن تكون متصلا خطوط كهربائية> يستخدم لنضح السوائل إلى تصفية ™ Vacushield لمنع التلوث من مضخة فراغ.</li><liويجب تطهيرها> جميع المختبرات المتضررة مقاعد البدلاء قمم بعد الانتهاء من العمل مع<em> T. الغوندية</em> البيضات. وينبغي بذل حديثا هيبوكلوريت 10 ٪ تطبق بحرية لمنطقة العمل والسماح جافة. ثم يجب أن تكون منطقة تشطف جيدا بالماء.</li></ol><p class="jove_title"> 2. إعداد مخازن والحلول</p><ol><li> إعداد 1 حل ل م 2.2 من السكروز عن طريق إذابة 752.66 غرام من السكروز في DDH 600 مل₂ O. اثارة والحرارة بلطف باستخدام لوحة اثارة ساخنة حل السكروز. مرة واحدة حلت تماما ، ليصل حجم 1 لتر مع DDH₂ O. وينبغي أن يتبع ذلك التعقيم التعقيم هو الحل لما لا يقل عن 20 دقيقة.</li><li> إعداد TE 1L العازلة (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 10 ملي EDTA) ، ودرجة الحموضة 7.2 بإضافة 6.05 غرام من حمض الهيدروكلوريك تريس ، و 3.7 غرام من EDTA في 700 مل من DDH₂ O ، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 ثم ​​جعل حجم إلى 1 لتر مع DDH₂ O.</li><li> للحصول على التدرج CSCL ، يعد حل سهم CSCL مع الثقل النوعي 1.15 (1.15 CSCL) بإضافة 21.75 غراما من CSCL مع 103.25 مل من مخزن الشركة المصرية للاتصالات. أجل التوصل إلى حل ، ومزيج من 30 مل TE مع 20 مل من CSCL – 1.15. ل B محلول ، مزيج 20 مل من TE مع 30 مل من CSCL – 1.15 و 12.5 ميكرولتر من محلول الفينول الأحمر. الحل ل C ، مزيج 10 مل من TE مع 40 مل من CSCL – 1.15 (الجدول 1).</li><li> إعداد 1L حل N 1 من هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) عن طريق إذابة 40 جم من هيدروكسيد الصوديوم في 800 مل من DDH₂ O. حل مرة واحدة ، ليصل حجم 1 لتر مع DDH₂ O.</li><li> إعداد حل L 1 2 ٪ (من حيث الحجم) من H₂ SO₄ خلط 20 مل من H₂ SO₄ مع 980 مل من DDH₂ O.</li></ol><p class="jove_title"> 3. السكروز تطفو</p><ol><li> أضف 10 مل من البراز للتعليق<em> T. الغوندية</em> البيضات ، في 2 ٪ H₂ SO₄ ، في أنبوب 50 مل الطرد المركزي المخروطية. يجب أن يلاحظ أن التعليق يشير إلى عينات البراز التي تم تجهيزها مسبقا من خلال تعويم السكروز الداخلي كما هو موضح سابقا⁸. عندما يتم حصادها في البداية عينات من براز القطط المصابة ومعالجتها من خلال تعويم السكروز كما هو موضح في مرجع 8. تطفو هذه السكروز إضافية ضرورية للحد من مزيد من الحطام برازي ترحيلها إلى عملية تنقية CSCL والحصول على أنقى<em> T. الغوندية</em> البيضات ممكن.</li><li> تحييد H 2 ٪₂ SO₄ بإضافة 6 مل (3 / 5 مجلدات) من هيدروكسيد الصوديوم N 1 إلى تعليق البراز. مزيج جيد من قبل vortexing.</li><li> إضافة حجم مساو (16 مل) من السكروز 2.2 M خلق تركيز النهائي من 1.1 م إلى تعليق برازي ومزيج جيد من قبل vortexing.</li><li> تراكب بعناية السكروز / التعليق برازي مع 10 مل DDH₂ O باستخدام ماصة 10 مل. تعليق الطرد المركزي في 1200 x ج لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون فرامل.</li><li> جمع بعناية المياه والطبقات العليا الطور البيني ونقل إلى أنبوب جديد 50 مل الطرد المركزي التي المخروطية pipetting من واجهة الهواء والماء دون تحريكها ماصة. فمن المهم للحد من المرحل السكروز في حين جمع طبقة الطور البيني.</li><li> مزيج من السكروز المتبقية / برازي حل بيليه vortexing بواسطة الأنبوب.</li><li> كرر الخطوات من 3.4 و 3.5.</li><li> إحضار حجم البيضة المتكيسة الطور البيني حلول اثنين إلى 50 مل مع DDH₂ O الطرد المركزي وأنابيب في 2000 x ج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li><li> نضح وطاف من كل أنبوب وكريات resuspend مع 5 مل TE العازلة وحمام سباحة تعليق البيضة المتكيسة معا. ينبغي أن يكون الحجم الكلي المجمعة 10 مل.</li></ol><p class="jove_title"> 4. CSCL الانحدار</p><ol><li> إعداد التدرج متقطع CSCL في 50 مل أنبوب البولي أوك ريدج التي تحتها بعناية كل طبقة باستخدام الحقنة 50 مل مع قياس 18 كليلة العضوية ، autoclavable وإبر والصلب ، ووقف الديك 2 الطريقة. ملاحظة : يضاف إلى أحمر الفينول باء حلول لتميز بسهولة بين طبقات متدرجة (الجدول 1).</li><li> إضافة ببطء الحلول التالية لأنبوب في النظام المدرجة أدناه. تجدر الإشارة إلى أن معدل التدفق يجب أن لا تتجاوز أكثر من 0.5 مل / ثانية.<ol><li> 10 مل من العينة تعليق TE / البيضة المتكيسة</li><li> الحل مل 8 A</li><li> 8 مل محلول B</li><li> 8 مل محلول C</li></ol></li><li> جهاز طرد مركزي أنبوب أوك ريدج في XG 12000 لمدة 60 دقيقة على 4 درجات مئوية مع عدم وجود الفرامل. استخدام الدوار زاوية ثابتة غير مقبول ، ولكن سرعة عالية في دلو يتأرجح نتائج أفضل فصل البيضات من العينة تعليق الحطام مع الحد الأدنى من مسحات البراز على طول الجانب أو الأنبوب مدى مسحات يتوقف على تشكيل لتعليق البراز وبالتالي قد يكون من الضروري لتنفيذ two التدرجات CSCL إذا كان تعليق البراز قذر للغاية.</li><li> وبعد الطرد المركزي ، وجمع الفرقة البيضة المتكيسة مبهمة / بيضاء تحتوي على ما بين ألف وباء حلول لتقليل تلوث برازي مع الحطام ، انتقل مباشرة إلى الفرقة البيضة المتكيسة دون إزعاج التدرج وجمع البيوض المتكيسة الطور البيني باستخدام ماصة 10 مل. نقل البيضة المتكيسة الطور البيني لأنبوب جديد للطرد المركزي 50 مل المخروطية. في محاولة لتقليل كمية من محلول CSCL يستنشق بينما جمع البيوض المتكيسة الطور البيني لأنه قد يسبب مشكلة في التكوير والبيضات خلال الخطوة يغسل.</li><li> اغسل البيضات مع مل 30-40 من DDH₂ O. أنبوب الطرد المركزي في 2000 XG في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة مع عدم وجود الفرامل. نضح بعناية وطاف دون الإخلال بيليه البيضة المتكيسة. تكرار غسل 2 مرات إضافية.</li><li> في نهاية غسل النهائي ، نضح بعناية وطاف في resuspend بيليه في 10 مل حامض الكبريتيك 2 ٪ وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. البيضات الآن على استعداد لمزيد من التلاعب. يمكن التحقق من نقاء البيضة المتكيسة المجهر بسبب عدم وجود الحطام برازي في العينة.</li></ol