Gewinnung von hochgradig gereinigter Toxoplasma gondii Oocysten durch eine diskontinuierliche Cäsiumchloridgradienten

Summary

Diese Studie beschreibt die Entwicklung eines modifizierten CsCl-Methode, die leicht reinigt T. gondii Oozysten aus Kot von infizierten Katzen, die geeignet sind für molekularbiologische und Gewebekulturen Manipulation

Abstract

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulären Protozoen Erreger, die häufig Menschen infiziert. Es ist ein gut charakterisierter apicomplexan mit verursacht durch Lebensmittel und Wasser übertragene Seuchen verbunden. Der Endwirt ist die Katze Arten, bei denen sexuelle Replikation in der Entwicklung der hoch ansteckenden und umweltfreundlich beständig oocyst was geschieht. Die Infektion erfolgt über die Aufnahme von Zysten aus kontaminiertem Fleisch oder Oozysten aus dem Boden oder Wasser. Die Infektion erfolgt in der Regel asymptomatisch in gesunden Personen, aber die Ergebnisse in eine lebenslange latente Infektion, die Reaktivierung verursachen Toxoplasmose-Enzephalitis und Tod, wenn das Individuum wird immungeschwächten können. Fleisch mit T. kontaminierte gondii Zysten haben die primäre Quelle der Infektion in Europa und den Vereinigten Staaten, aber die jüngsten Veränderungen in der Tierhaltung und Tierhaltung und verbessert den Umgang mit Lebensmitteln und Verarbeitungsverfahren haben wesentlich die Prävalenz von T. reduziert gondii Zysten in Fleisch ^{1, 2.} Dennoch bleibt Seroprävalenz beim Menschen relativ hohe darauf hindeutet, dass Exposition von Oozysten kontaminierten Boden oder Wasser auftreten. In der Tat haben auf Wasserbasis Ausbrüche von Toxoplasmose gemeldet weltweit unterstützen die Theorie der Exposition gegenüber der Umwelt oocyst Form stellt eine erhebliche Gesundheitsgefährdung ^3-5. Bis heute Forschung zum Verständnis der Prävalenz von T. gondii Oozysten im Wasser und Umwelt sind durch den Mangel an Tools, um Oozysten in der Umwelt ^{5, 6} erkennen begrenzt. Dies ist vor allem auf den Mangel an effizienten Reinigung Protokolle für die Gewinnung einer großen Anzahl von hochreinem T gondii Oozysten aus infizierten Katzen zu Forschungszwecken. Diese Studie beschreibt die Entwicklung eines modifizierten CsCl-Methode, die leicht reinigt T. gondii Oozysten aus Kot von infizierten Katzen, die sich für molekularbiologische und Gewebekulturen Manipulation ⁷ sind.

Protocol

<p class="jove_title"> 1 ist. Allgemeine Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit<em> T. gondii</em> Oozysten</p><ol><li> Es ist wichtig, alle Sicherheitsvorkehrungen zu folgen, wenn die Arbeit mit<em> T. gondii</em> Oozysten. In den meisten gesunden Menschen,<em> T. gondii</em> Infektion ist leicht durch das Immunsystem kontrolliert, aber ein Leben lang Infektion führt. Immungeschwächten Personen sind besonders anfällig für Toxoplasmose und sollte nicht mit<em> T. gondii</em> Oozysten. Schwangere Frauen sollten auch nicht mit<em> T. gondii</em> Oozysten, weil Infektion schwerer Geburtsfehler verursachen kann,⁸.</li><li<em> T. gondii</em> Oozysten sollten nur in einem bestimmten Bereich und mit geschultem Personal gehandhabt werden. Hinweisschilder<em> T. gondii</em> Oocyst Arbeit ist im Gange sind geschrieben, andere in die vorgesehenen Bereich aufmerksam zu machen.</li><li> Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), wie Laborkittel, Einweg-Kittel, Einweghandschuhe und angemessenen Augenschutz bzw. Gesichtsschutz beim Umgang mit<em> T. gondii</em> Oozysten.</li><li> Häufige Handschuh Änderungen empfohlen. Fassen Sie alle Laborgeräte mit<em> T. gondii</em> Oocyst Handschuhen kontaminiert.</li><li> Immer Metall autoklavierbar Tabletts mit einer Einwegabsorptionsartikel Liner ausgekleidet bei der Arbeit mit<em> T. gondii</em> Oozysten. Sicherstellen, dass alle Racks, Röhren, etc. verwendet werden entweder Einweg-oder autoklavierbar.</li><li> Alle<em> T. gondii</em> Abfälle müssen zweimal für mindestens eine Stunde autoklaviert werden.</li><li> Alle Nicht-Einweg-Geräte (Racks, Schalen, etc.) müssen ebenfalls zweimal für mindestens eine Stunde autoklaviert werden.</li><li> Vakuum-Leitungen verwendet werden, um Flüssigkeiten absaugen sollte zu einer Vacushield ™-Filter verbunden werden, um eine Kontamination der Vakuumpumpe zu verhindern.</li><li> Alle betroffenen Labortisch-Tops muss nach Abschluss der Arbeiten mit desinfiziert werden<em> T. gondii</em> Oozysten. Frisch aus 10% Hypochlorit sollte großzügig auf die Arbeitsfläche aufgetragen werden und erlaubt trocken. Die Fläche muss dann gut mit Wasser abgespült werden.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Herstellung der Puffer und Lösungen</p><ol><li> Bereiten Sie einen 1 L 2,2 M Lösung von Saccharose durch Auflösen von 752,66 g Saccharose in 600 ml ddH₂ O. Umrühren und Hitze vorsichtig mit einem beheizten Rührplatte der Saccharose aufzulösen. Einmal vollständig gelöst, bringen Volumen auf 1 l mit ddH₂ O. Dies sollte durch die Sterilisation im Autoklaven die Lösung für mindestens 20 Minuten eingehalten werden.</li><li> Bereiten Sie eine 1L TE-Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA), pH 7,2 durch Zugabe von 6,05 g Tris-HCl und 3,7 g EDTA in 700 ml ddH₂ O, pH-Wert einstellen auf 7,2 dann bringen Volumen auf 1 l mit ddH₂ O.</li><li> Für die CsCl-Gradienten, bereiten eine Stammlösung von CsCl mit einem spezifischen Gewicht von 1,15 (1,15-CsCl), indem 21,75 g CsCl mit 103,25 ml TE-Puffer. Für Lösung A, mix 30 ml TE mit 20 ml 1.15-CsCl. Für Lösung B, Mix 20 ml TE mit 30 ml 1.15-CsCl und 12,5 ul Phenol rote Lösung. Für die Lösung C, Mischung von 10 ml TE mit 40 ml 1.15-CsCl (Tabelle 1).</li><li> Bereiten Sie eine 1L 1 N Lösung von Natriumhydroxid (NaOH) durch Auflösen von 40 g NaOH, in 800 ml ddH₂ O. Nach der Auflösung bringen Volumen auf 1 l mit ddH₂ O.</li><li> Bereiten Sie einen 1 L 2% (nach Volumen) Lösung von H₂ SO₄ Mischen von 20 ml H₂ SO₄ Mit 980 ml ddH₂ O.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Sucrose float</p><ol><li> 10 ml einer fäkalen Aussetzung der<em> T. gondii</em> Oozysten, in 2% H₂ SO₄, In einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Anzumerken ist, dass fäkale Suspension Proben wurden durch eine Saccharose Flotation Verfahren wie zuvor beschrieben vorverarbeitet bezieht sein⁸. Wenn der Stuhlproben zunächst aus dem infizierten Katzen geerntet werden sie durch eine Saccharose-Float in Bezug 8 beschrieben verarbeitet. Diese zusätzliche Saccharose float ist notwendig, um weiter zu minimieren fäkale Verunreinigungen über die CsCl Reinigungsprozess durchgeführt und erhalten die reinste<em> T. gondii</em> Oozysten möglich.</li><li> Neutralisieren die 2%-H₂ SO₄ Durch Zugabe von 6 ml (5.3-Volumes) von 1 N NaOH auf die fäkale Suspension. Gut mischen durch Vortexen.</li><li> Add gleichem Volumen (16 ml) von 2,2 M Saccharose Erstellung einer Endkonzentration von 1,1 M auf die fäkale Federung und gut mischen durch Vortexen.</li><li> Vorsichtig überlagern die Saccharose / fäkal Suspension mit 10 ml ddH₂ O mit einer 10 ml Pipette. Die Suspension bei 1.200 xg für 20 min bei Raumtemperatur ohne Bremse.</li><li> Sorgfältig sammeln top Wasser und Interphase Schichten und an einem neuen 50 ml konische Zentrifugenröhrchen durch Pipettieren aus der Luft-Wasser-Grenzfläche ohne Verwirbelung der Pipette. Es ist wichtig, Saccharose Verschleppung zu minimieren, während das Sammeln der Interphase-Schicht.</li><li> Mix die restlichen Saccharose / fäkal Pellet-Lösung durch Vortexen der Röhre.</li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,4 und 3,5.</li><li> Bringen Sie die Lautstärke der beiden oocyst Interphase-Lösungen auf 50 ml mit ddH₂ O und zentrifugieren bei 2.000 xg für 10 Minuten bei Raumtemperatur.</li><li> Den Überstand aspirieren aus und die Dynabeads Pellets mit 5 ml TE-Puffer und Pool der Oozysten Federung zusammen. Der gesamte Pool-Volumen sollte 10 ml werden.</li></ol><p class="jove_title"> 4. CsCl-Gradienten</p><ol><li> Bereiten Sie einen diskontinuierlichen CsCl-Gradienten in einer 50 ml Polycarbonat Oak Ridge Röhrchen durch vorsichtiges Unterlegen jede Schicht mit einer 50 ml Spritze mit einer 18-Gauge-blunt-ended, autoklavierbar, Stahlnadel und einem 2-Wege-Hahn. Hinweis: Phenolrot ist die Lösung B hinzugefügt, um leicht zwischen den Gradienten-Schichten (Tabelle 1) zu unterscheiden.</li><li> Langsam fügen Sie die folgenden Lösungen für das Rohr in der angegebenen Reihenfolge. Es wird darauf hingewiesen, dass die Strömungsgeschwindigkeit sollte nicht mehr als 0,5 ml / sec werden.<ol><li> 10 ml des TE / oocyst Suspensionsprobe</li><li> 8 ml Lösung A</li><li> 8 ml Lösung B</li><li> 8 ml Lösung C</li></ol></li><li> Centrifuge die Oak Ridge Röhrchen bei 12.000 xg für 60 min bei 4 ° C ohne Bremse. Die Verwendung eines Festwinkelrotor ist akzeptabel, aber mit hoher Geschwindigkeit Ausschwingrotor führt zu einer besseren Trennung der Oozysten aus der Suspension Probe mit minimalem fäkale Verunreinigungen Abstriche an der Seite oder das Rohr. Das Ausmaß der Abstriche hängt von der Zusammensetzung der fäkalen Suspension und damit kann es erforderlich sein, um zwei CsCl-Gradienten durchzuführen, wenn die fäkale Federung ist extrem verschmutzt.</li><li> Nach der Zentrifugation sammeln die opaken / weiß Oozysten mit Band zwischen Lösungen A und B. Um eine Kontamination mit fäkalen Verunreinigungen zu minimieren, gehen Sie direkt auf die Oozysten Band, ohne die Steigung und sammeln die Oozysten Interphase mit einer 10 ml Pipette. Übertragen Sie die Oozysten Interphase in ein neues 50 ml konische Zentrifugenröhrchen. Versuchen Sie, die Höhe der CsCl-Lösung abgesaugt minimieren, während das Sammeln der Oocysten Interphase, wie es ein Problem in Pelletierung der Oozysten in den Waschschritt darstellen können.</li><li> Wash Oozysten mit 30-40 ml ddH₂ O. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2.000 xg bei Raumtemperatur für 10 min ohne Bremse. Vorsichtig absaugen der Überstand ohne die Oozysten Pellet. Wiederholen Sie die Wäsche zusätzlich 2 mal.</li><li> Am Ende der letzten Waschen sorgfältig absaugen der Überstand und das Pellet in 10 ml 2% iger Schwefelsäure und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. Oozysten sind nun bereit zur weiteren Bearbeitung. Oozysten Reinheit kann mikroskopisch durch das Fehlen von fäkalen Verunreinigungen in der Probe überprüft werden.</li></ol