Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging
Summary
Volwassen hartspiercellen zijn primaire cellen die kunnen worden geïsoleerd uit dierlijke harten en gekweekt voor meerdere dagen. Binnen deze cultuur periode adenovirale gentransfer kan gebruikt worden om genetisch gecodeerd biosensoren (GEBS) of TL-fusie-eiwitten uit te drukken. Beide benaderingen laten cellulaire onderzoeken door middel van confocale microscopie.
Abstract
Cardiale myocyten geïsoleerd uit volwassen hart is algemeen aanvaard als een model ergens halverwege tussen embryonale en neonatale spiercellen aan de ene kant en een werkend hart op de andere. Dus, cardiomyocyten dienen als goede modellen voor cardiale cellulaire fysiologie en pathofysiologie, voor farmaceutische onderzoek en voor de exploratie van transgene diermodellen. Hier beschrijven we een methode voor het isoleren van de cellen van het hart. Verder hebben we laten zien hoe een genetische manipulatie op de cardiale myocyten kan worden uitgevoerd zonder dat het fokken van een transgeen dier: Dit is de combinatie van lange termijn cultuur (1 week) en adenovirale gentransfer. Dit laatste is beschreven van de bouw van het virus naar de transductie van de cellen. Het kan worden gebruikt voor de expressie van genetisch gecodeerde biosensoren (GEBS), TL-fusie-eiwitten, maar ook voor eiwit overexpressie en neer regelgeving, bijvoorbeeld met behulp van RNAi. Hier hebben we een voorbeeld voor de expressie van een fusie-eiwit vlekken een subcellulaire structuur (Golgi). Dergelijk eiwit expressie kan gevisualiseerd worden door confocale beeldvorming van z-stacks voor een 3D-reconstructie van subcellulaire structuren. Het protocol bestaat uit state-of-the-art in celkweek, moleculaire biologie en biofysica en dus biedt een aanpak voor het verkennen van nieuwe horizonten in de cellulaire cardiologie.
Protocol
Discussion
De procedure beschreven voor het isoleren van de cardiomyocyten van de rat kan worden aangepast aan andere soorten, zoals de muis 4, indien nodig. Een parameter die aanpassing nodig heeft, is het enzym mix voor de spijsvertering (zie hieronder) en ook de duur van de spijsvertering. Wees ervan bewust dat de cellen van sommige soorten (bijvoorbeeld een muis) zou kunnen worden kwetsbaarder zijn dan andere (bv. rat).
De keuze van collagenase is waarschijnlijk de meest cruciale stap in…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Duitse National Science Foundation (DFG) en door de Federale Institute for Risk Assessment (BfR, Duitsland).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
| DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
| Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
References
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
- Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
- Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. . Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
