Выделение и генетических манипуляций взрослых кардиомиоцитов для конфокальной микроскопии
Summary
Взрослых кардиомиоцитов являются первичные клетки, которые могут быть изолированы от животного сердца и культивировали в течение нескольких дней. В рамках этой культуры периода аденовирусных перенос генов могут быть использованы для выражения генетически закодированы биосенсоров (GEBs) или флуоресцентные белки слияния. Оба подхода позволяют сотовой исследования с помощью конфокальной микроскопии.
Abstract
Кардиомиоцитов изолированных от взрослых сердца широкое признание в качестве модели где-то на полпути между эмбриональной и неонатальной мышечные клетки с одной стороны и работающем сердце, с другой. Таким образом, кардиомиоцитах служат хорошими моделями для сердечной клеточной физиологии и патофизиологии, для фармацевтических исследований, а также для исследования трансгенных животных моделях. Здесь мы опишем метод выделения клеток из сердца. Кроме того, мы покажем, как генетические манипуляции на кардиомиоциты могут быть выполнены без разведения трансгенных животных: Это сочетание длинных культуры срок (1 неделя) и аденовирусных переноса генов. Последняя описывается от строительства вируса трансдукции клеток. Она может быть использована для выражения генетически закодированы биосенсоров (GEBs), флуоресцентные белки слияния, но и для белка за выражение и вниз регулирования, например, с помощью РНК-интерференции. Здесь мы приведем пример для выражения гибридный белок окрашивания субклеточные структуры (АГ). Такой экспрессии белка могут быть визуализированы с помощью конфокальной визуализации Z-стеки для 3D-реконструкция субклеточных структур. Протокол включает в себя состоянии дел в культуре клеток, молекулярной биологии и биофизики и таким образом обеспечивает подход для изучения новых горизонтов в сотовых кардиологии.
Protocol
Discussion
Процедуре, описанной для выделения кардиомиоцитов крысы могут быть адаптированы для других видов, например, мыши 4, если это необходимо. Параметром, который необходимо адаптации фермент смесь для пищеварения (см. ниже), а также продолжительность пищеварения. Имейте в виду, что кле?…
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Немецкого Национального научного фонда (DFG) и Федерального института оценки рисков (BfR, Германия).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
| DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
| Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
References
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
- Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
- Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. . Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
