Visualisering Singel molekylkomplex In Vivo Använda avancerade fluorescensmikroskopi
Summary
Här kan vi visa protokoll för att utföra en enda molekyl fluorescensmikroskopi på levande bakterieceller att funktionella molekylära komplex som ska upptäckas, spåras och kvantifieras.
Abstract
Full insyn i de mekanismer i levande celler kan endast uppnås genom att undersöka viktiga processer som framkallar och direkta händelser på cellnivå. Hittills skjuvning komplexiteten i biologiska system har orsakat exakt enda molekyl experiment för att vara alltför krävande, i stället för att fokusera på studier av enskilda system som använder relativt grova bulk ensemble-genomsnittet mätningar. Men många viktiga processer sker i den levande cellen i nivå med bara en eller ett fåtal molekyler, ensemble mätningar generellt maskera stokastiska och heterogena dessa händelser. Här med hjälp av avancerad optisk mikroskopi och analytiska bild analysverktyg vi visar hur man kan övervaka proteiner i en enda levande bakterie med en precision av enstaka molekyler och hur vi kan observera dynamiken inom molekylär komplex i fungerande biologiska maskiner. De tekniker som är direkt relevanta fysiologiskt. De är minimalt perturbative och icke-invasiv till biologiskt prov som undersöks och är fullt anpassad för utredningar i levande material, funktioner som inte är tillgängliga för andra en-molekyl strategierna i biofysik. Dessutom studerade biologiska prover alla producerar fluorescerande-märkta proteinet på nivåer som är nästan identiska med omodifierade celler stammar ("genomisk kodning"), i motsats till den vanligare men mindre bra metod för att generera betydligt mer protein än vad som förekommer naturligt (plasmid uttrycket "). Således, den verkliga biologiska prover som kommer att undersökas är betydligt närmare den naturliga organismer, och därför iakttagelser mer relevanta för verkliga fysiologiska processer.
Protocol
Discussion
Man måste vara försiktig att inte "över shear" cell för att titta på bundna bakterier, eftersom detta kan försämra funktionaliteten hos flagellar motorer. Det är viktigt att använda celler för mycket längre än en timme en gång på objektglas eftersom de kan bli syrefattigt. Betydande optimering kan krävas för att hitta den bästa mikroskopet avbildning villkor tillgodoses dina specifika biologiska systemet under utredning. Det kan vara klokt att försöka sig på avbildning med renat GFP ensam a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner den typ donationer av bakteriestammar från grupper av Prof. Judith Armitage (University of Oxford, Storbritannien) och professor Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London, Storbritannien). IMD finansieras gemensamt av Institutionen för biokemi (Oxford University) och OCISB, AR finansieras av en Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) DTC utbildningsbidrag, ND finansieras från bioteknik och Biological Sciences Research Council (BBSRC), MCL är finansieras av en Royal Society University Research Fellowship.
References
- Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
- Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).
- Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay. Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).
- Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay. FEBS Lett. , 535-555 (2003).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane. Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane. Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli. Biophys. 93, 294-302 (2007).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells. Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).
