הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Summary

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

Abstract

התובנה המלאה לתוך המנגנונים של תאים חיים יכולה להיות מושגת רק על ידי חוקר את תהליכי המפתח לעורר ולכוון אירועים ברמה התאית. עד כה מורכבות גזירה של מערכות ביולוגיות גרמה ניסויים מדויקים מולקולה בודדת להיות תובעני מדי, במקום התמקדות במחקרים של מערכות יחיד באמצעות בתפזורת גולמי יחסית ההרכב הממוצע מדידות. עם זאת, תהליכים חשובים רבים המתרחשים בתא החי ברמה של רק אחת או כמה מולקולות; מדידות ההרכב כלל להסוות את טבעו סטוכסטיים והטרוגניות של אירועים אלה. כאן, בעזרת מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת כלי ניתוח אנליטיים תמונה אנחנו מדגימים כיצד לפקח חלבונים בתוך תא חי בודד החיידק עד לדיוק של מולקולות בודדות וכיצד אנו יכולים לצפות הדינמיקה בתוך קומפלקסים מולקולריים בתפקוד מכונות ביולוגיות. טכניקות רלוונטיים ישירות פיזיולוגית. הם מינימלית perturbative ולא פולשנית המדגם ביולוגי תחת לימוד מכוונים באופן מלא בחקירות בחומר חי, תכונות לא זמינים מולקולה בודדת גישות אחרות של ביופיזיקה. בנוסף, דגימות ביולוגיות למד לייצר כל חלבון fluorescently-tagged ברמות אשר כמעט זהים לצלילי תא ללא שינוי ("הקידוד הגנומי"), בניגוד לגישה נפוצה יותר אך פחות אידיאלי להפקת חלבון משמעותי יותר היה להתרחש באופן טבעי ('פלסמיד ביטוי "). לפיכך, בפועל דגימות ביולוגיות אשר תיחקר באופן משמעותי קרוב יותר אורגניזמים טבעיים, ולכן התצפיות רלוונטי יותר תהליכים פיזיולוגיים אמיתי.

Protocol

1. כדי להתחיל בהליך זה, 50 μl של מניות קפוא של חלבון פלואורסצנטי להביע coli Escherichia תאים חיידקיים הם מפשיר הראשון גדלו aerobically עם רועד 5 מ"ל LB התקשורת צמיחה לילה ב 37 מעלות צלסיוס בבוקר, 50 μl של תרבות זו רווי מופק ותת תרבות מינימלית M63 לתוך תרבות מדיה גלוקוז, דוגרים ב-C 30 מעלות למשך 4 עד 6 שעות. כאן אנו מדגימים באמצעות שני זני תאים שונים, אשר אחד מהם מבטא העברת אלקטרונים ציטוכרום התמזגו GFP, השני המבטא חלבון מעורב המנוע flagellar חיידקי התמזגו GFP.
2. תאים עשויים לקצור במישרין מן התרבות קטן גדל אם הצפייה בהם דגימות משותקת, או שהם עשויים להיות טעון לחתוך שוטונים חיידקי אם צפייה בתנאים "קשור".
3. שירינג כרוך בדרך כלל הצבת 1-5 מ"ל של תרבות המשנה לתוך מכשיר המורכב משתי מזרקים סטריליים הצטרפו צנרת סטרילית. הגז נעשית על ידי לסירוגין דוחפים משאבה כל מזרק כדי לדחוף את תרבות דרך צינור צר. הדבר נעשה 5-10 פעמים, בהתאם להיקף הגז הנדרשת. תרבות היא centrifuged אז גלולה התאים, אשר resuspended בתקשורת מינימלי להסיר שברי שוטונים.
4. לאחר מכן אנו מכינים לנקות BK7 coverslips זכוכית ידי טבילה בתמיסה רוויה של KOH באתנול במשך 20 דקות, ואז לשטוף ביסודיות במים דה מיונן אתנול ולהשאיר לייבוש באוויר לפחות 1 ח
5. אנחנו פשוט לבנות תזרים תאים לבית התאים במיקרוסקופ. זה כרוך ציור קווים של שומן פרפין על שקופית BK7 מיקרוסקופ זכוכית ולאחר מכן יצירת מנהרה-כריך ידי הצבת אחד coverlips ניקו למעלה, ולחיצה מטה בעדינות עם זוג מלקחיים, נותן נפח תא זרימה של μl 5-10 .
6. כדי לצפות בתאים משותקת אנחנו ממלאים את זרימת תאים בזריקה עם פתרון w / v 0.1% פולי-L-ליזין, ולאפשר לו דגירה בטמפרטורת החדר למשך דקות לפחות 1. לאחר מכן לשטוף החוצה באמצעות מדיה מינימלי 100 μl ידי הזרקת התקשורת מקצה אחד של התא זרימה ועל הפתילה בנייר טישו מהשני.
7. לאחר מכן, אנו הפתיל דרך μl 20 של דילול 1:500 בקוטר של 200 ננומטר לטקס microspheres (Polysciences) בתקשורת מינימלי כדי לסמן את השטח coverslip. זרימת תאים הוא הפוך כזה coverslip פונה כלפי מטה, מונח על מצע ברור של השטח בתא לחות פשוט, מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. חרוזים מאוגד נשטפים אז במרחק של 100 הפתילה דרך התקשורת מינימלי μl.
8. אם אנו רוצים לשמור התאים קשורים אנו להשמיט את הצעד poly-L-ליזין, ובמקום למלא את זרימת תאים עם נוגדן אנטי flagellin 5 מ"ג / מ"ל. זרימת תא הוא מקום בתא לחות במשך 10 דקות, והוא הסמיק מכן דרך על ידי הפתילה.
9. 20 μl של התרבות התא ואז הרשעים דרך התא זרימה, בין אם באמצעות מדגם טעון התבוננות אם התאים קשורים או מדגם unsheared ב צפייה תאים משותקת.
10. זרימת תאים היא הפוכה והניח בתא לחות עבור 20 דקות. תאים מאוגד נשטפים החוצה ואז על ידי מדיה הפתילה דרך 100 μl מינימלי.
11. טיפה של שמן טבילה ממוקם במרכז המשטח העליון של coverslip ואת זרימת תאים ממוקם אז בעדינות לבעל המדגם של מיקרוסקופ פלואורסצנטי המנהג בנוי, ביצירת קשר עם עדשה אופטית מטרה גבוהה מספרי הצמצם.
12. המצלמה מיקרוסקופ אלקטרונים הכפלת מופעל ונמצא המצלמה מוגדר להיות מקורר -70 מעלות צלזיוס, התוכנה מוגדרת לרכוש תמונות בקצב מסגרת טיפוסית של 25 הרץ במצב מסגרת העברה, בתחילה disenabling לקבל שליטה על המצלמה.
13. תאורה brightfield מופעל ואת התמונה הוא הביא אל המוקד, בחירת תא או קבוצת תאים מתאים להיות צילמו על בסיס היותם תקועים עם מקביל לציר הארוך שלהם אל פני השטח coverslip. הדגש הוא מותאם היטב על מנת להבטיח כי לטקס 200 ננומטר חרוזים תקוע אל פני השטח coverslip הם רק בפוקוס.
14. רצף התמונה היא רכשה brightfield להקליט את קווי המתאר של גוף התא. תאורה brightfield הוא כיבה את המצלמה מופעלת רווח מרבי.
15. עבור רכישת תקן באמצעות השתקפות מסך פלואורסצנטי פנימי (או TIRF) קרן לייזר על הגל המתאים (כאן, עירור ירוק חלבון פלואורסצנטי, אנו משתמשים לייזר 473 ננומטר) היא שנקבע מראש כדי להיות ממוקד במישור המוקד האחורי של העדשה אובייקטיבי אבל העקורים רוחבית מהציר האופטי כדי ליצור שדה חלוף עבור עירור הקרינה לתוך המדגם התא.
16. הרכישה המצלמה התחיל את התריס נפתח לייזר כדי להלהיב את חלבוני ניאון בתוך החיידק. הפרמטרים עבור עוצמת הלייזר ואת המהירות של הרכישה צריך להיות מותאם למערכת ביולוגית מסוימת תחת חקירה על ידי התנסות עם ערכים שונים, אלא מגוון טיפוסי relevant ללימוד קומפלקסים חלבונים ניידים קרום התא הם 1-10 כוח mW הלייזר על פני שטח עירור עגולה בקוטר ~ 30 מיקרומטר, עם זמן חשיפה לכל מסגרת של 50-40 אלפיות השנייה. דוגמאות מוארים עד photobleached, בדרך כלל עבור ~ 10 s.
17. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור תאים קשור בו גוף התא הוא מסתובב על נקודת ההתקשרות בין coverslip ועל בדל flagellar, ועל תאים משותקת אשר קבועים ונוקשים אל פני השטח coverslip.
18. כמה זנים התא שבו יש מספר גבוה עותק של קומפלקסים תועלת אקונומיקה הראשונית עקיפה מוגבל לייזר ממוקדת על מוט אחד של התא לפני TIRF הדמיה. אקונומיקה זה שווה כי בשימוש התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (או FRAP). באמצעות מיקרוסקופ המנהג שלנו קצת אור לייזר עירור יכול להיות מוזן לתוך נתיב עצמאי second המשמש FRAP מסוג הלבנה. בדרך כלל 1-10mW כוח לייזר משמש, עם זמן אקונומיקה טיפוסי בטווח 10-300 מילישניות. התוצאה היא הרבה יותר גבוהה לעומת הדמיה באזור מולבן של התא ומאפשר מתחמי יחיד אשר לאחר מכן מפוזר לאזור זה יהיה בקלות רבה יותר דמיינו.
19. עבור חזותי מתחמי בציטופלסמה של התא אשר מפוזר הרבה יותר מהר מאשר אלה קרום התא מצב תאורה שונים בשם "slimfield" הוא מועסק. הנה לייזר ממוקדת מורחבת רוחבית כדי להקיף רק תא בודד. זה מייצר שדה חזק מאוד ומאפשר חשיפה הרבה יותר מהר בדרך כלל של אלפית השנייה להילקח.
20. בעקבות הרכישה נתונים, תמונות מוזנים לתוך התוכנה כתובה מותאמת אישית (מקודד LabVIEW 8.5). זה מזהה אוטומטית את עמדות נקודות פלורסנט בתאים עד לדיוק של ננומטרים ספורים בדרך כלל ותמציות גודלם ואת הבהירות. Brightnessof עקבות photobleaching ביחס לזמן ממכלול מולקולרית מעקב לאחר מכן נעשה שימוש כדי להעריך את stoichiometry, כלומר כמה חלבוני ניאון הפרט לפצות קומפלקס מולקולרי יחיד.

נציג תוצאות:

כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה את התמונות של התאים שנצפו ב brightfield שונה מאוד, עם היקפה של גופי התא כהה נגד גוף תא לבן / אפור (איור 1 א). ב הקרינה משותקים באמצעות תאים, אנו יכולים לראות עוצמת כתמים ברורים, בדרך כלל של 250-300 ננומטר רוחב (איור 1b). בריאים, התאים קשורים יראו לסובב סביב נקודת ההתקשרות לקשור בתמונות brightfield. תחת עירור הקרינה מתחמי כמה מולקולרית במקרה שלנו יכול להיות גם לראות בנקודת ההתקשרות, מה שמעיד על לוקליזציה של החלבון מתוייגים עם המנוע flagellar. כתמים אלה הם קומפלקסים מולקולריים בודדים ומספר להם לראות יהיה תלוי במצב תאורה המשמשים וכמה מתחמי הם בעצם להציג בתא בכל רגע נתון. הניידות של כתמים תלוי מערכת ביולוגית ספציפית תחת מחקר. אם את הצפיפות של הנקודות בהתחלה הוא גבוה מאוד, כפי שקורה עם cytochromes שכותרתו משמש כאן, ולאחר מכן ביצוע אקונומיקה FRAP הראשוני יכול לשפר את הניגודיות הדמיה.

באיור 1. (א) brightfield ו (ב) התמונה TIRF (צבע שקר) עבור תא Escherichia coli משותקת לבטא חלבון התמזגו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) אשר ידוע להיות מעורב המנועים flagellar של חיידקים. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

Discussion

יש להקפיד שלא "על גזירה" התא מסתכל חיידקים קשור, שכן הדבר עשוי לפגום את הפונקציונליות של מנועים flagellar. חשוב להשתמש בתאי הרבה יותר משעה אחת בשקופית מיקרוסקופ שכן הם עלולים להפוך חמצן מדולדל. אופטימיזציה ניכרת ייתכן שיהיה צורך למצוא הדמיה את התנאים הטובים ביותר מיקרוסקופ ששירתה המערכת הביולוגית הספציפית שלך תחת חקירה. זה יכול להיות חכם לניסיון הדמיה באמצעות מטוהרים GFP לבד לברר את העוצמה הנכונה לייזר עירור הנדרש עבור מערכת מיקרוסקופ הספציפית שלך.