上颌Barbel斑马鱼的研究方法

Summary

斑马鱼的上颌barbel外皮感觉器官含有外胚层，中胚层和神经嵴衍生物。更重要的是，成人barbel可再生后近端截肢。本视频介绍上颌barbel开发和演示了手术协议，barbel标本收集，嵌入和下游成像诱导再生。

Abstract

触须是在鱼类，爬行动物和两栖动物的皮肤感觉附属物。斑马鱼， 斑马鱼 ，开发两对触须，短鼻对一个较长的上颌对。 Barbel组织中含有的外胚层，中胚层和神经嵴起源的细胞，包括皮肤细胞，腺体，味蕾，黑色素细胞，循环系统血管及感觉神经。不像大多数成人组织，上颌barbel是透明的，让我们这些组织类型的开发和维护整个生命周期的可视化。

该视频显示上颌barbel（受精后约1个月开始）的早期发展，并演示了手术的协议，在成人的附属物（> 3个月后施肥）诱导再生。简言之，麻醉鱼的左上颌窦barbel升高与远端尾椎上颌骨边缘的无菌镊子。罚款，无菌弹簧剪刀定位对镊子，在这一水平上削减barbel轴，建立了截肢平面解剖标志。这架飞机，并在比较对侧barbel蓄热式增长可测。 Barbel组织再生迅速，伤2个星期内达到最大的再生。

再生barbel分析技术包括解剖和嵌入在一个标准的DNA电泳井配对的触须（再生和控制）。方便嵌入式标本大体形态和形态学体视显微镜下拍摄的，可存储数周前，下游应用，如石蜡组织学，cryosectioning，和/或整装免疫组织化学。这些方法建立在体内组织系统内的斑马鱼的遗传背景下的多种类型的细胞的再生能力研究的新颖的上颌barbel。

Protocol

斑马鱼的饲养斑马鱼是按1标准方法安置和饲养。过去的后期幼虫时期，一个斑马鱼的发育阶段可以衡量它的标准长度（SL），或从上唇anteriormost的角度以毫米为单位的直线距离尾鳍（posteriormost hypural板）的基础2。在受精后约一个月（SL 10-12毫米），鼻和上颌骨的触须出现嗅觉坑附近的颚后的角落，分别为透明上皮芽。由于斑马鱼的成熟，触须延伸到狭窄，晶须状的附加物。由于上颌barbel较大（2-3毫米），更易于操作，我们的协议只适用于这个特定的附属物;然而，类似的技术，可适应较小的鼻barbel。 Barbel裁剪在所需的阶段（例如，1.5-2.5厘米SL，〜3-6个月后受精）麻醉成年斑马鱼浸泡在0.015％的MS – 222（乙基氨基磺酸）缓冲系统水的pH值7.0。和鳃通风变得缓慢和定期观察，直到停止游泳运动。根据鱼的大小，完成麻醉大约需要2-5分钟。 使用水族馆渔网，一次传输一个在培养皿中的湿纸巾折叠1-3鱼。使用钝的铲，东方的鱼，所以他们是平行的相互左外侧的一面向上。在覆盖了整个身体的鳃盖鱼（鳃盖）在手术过程中保持湿润的皮肤和鳃尾部分湿纸巾的褶皱部分。 体视显微镜下的Petri板，采用低角度的入射光照射头部区域。专注于左上颌窦barbel，突出从上颌骨后腹角（图1）的基础。 图1。 紧紧抓住的barbel颌骨边缘略有远端轴。提升barbel轴，并插入一个细尖的春天剪刀钳的近端的下颌。可触及的剪刀，镊子稳定。滑动轴的barbel剪刀的颌骨，直到尖端接近颌骨边缘。关闭剪刀划破barbel轴。截肢barbel，仍然笼罩在镊子，可用于固定或进一步的观察中删除。 马上转移到一个干净的系统的水（约500毫升）含一滴亚甲蓝控制浅部真菌感染的小坦克鱼。让鱼一夜之间恢复。第二天早上，返回鱼的饲养系统。 Barbel再生是最大的，2周后。 琼脂嵌入匹配Barbel对通过适当的安乐死技术收集的鱼类和修复的4％，50毫升管多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）在4 ° C过夜搅拌。固定液的量应至少组织量的十倍。固定后，在核准的容器中的多聚甲醛废物处置和组织彻底冲洗PBS的几个变化。 准备一个250毫升的玻璃烧瓶150毫升的2％琼脂糖（ 的 Tm〜37 ° C）蒸馏水。微波炉或热板加热，搅拌至完全溶解定期。在50-60℃水浴平衡的熔融解决方案。 一个标准的凝胶电泳钻机组装放置一个小垫片胶的模具（10 × 10厘米〜100毫升凝胶体积）坚决反对的缓冲室的两侧。 2-4小齿样本的梳子（4 × 1.5毫米）。 在一个水平面上，倒入模具融化的琼脂糖刚好盖住的梳子基地，形成很浅水井。立即把剩余的琼脂糖回温水浴，这将在以后使用嵌入组织（步骤9-12）。一个长长的玻璃巴斯德吸管放入烧瓶中，保持相同的温度琼脂糖的吸管。 允许凝胶硬化20-30分钟。取出的梳子，然后删除包含从缓冲室，硬化凝胶的凝胶模具。坚决凝胶模具实验室磁带的磁带的开放两岸，使凝胶不会滑出。这盘录像带，应延长在琼脂糖表面几毫米，所以可以在以后添加额外的琼脂糖（13步）。 立体显微镜下阶段的凝胶模具的位置。放大一个空井，并把关注焦点的边缘。 上井相邻的琼脂糖表面，吸一滴的水或缓冲液固定barbel标本（ 例如，重新生成和控制）。 USI吴弯曲昆虫引脚，潮湿的标本，并将其推入井拖动底部。东方barbel轴相互平行，对井对面的长边对齐。表面张力，将有助于保持的组织中的地位。 当准备嵌入，使用罚款枪头或删除多余的液体从井实验室组织的角落。工作很快，所以不要让组织干出来的。 使用加热玻璃巴斯德吸管，轻轻吸液管和周围的标本新鲜熔化琼脂糖密封barbel组织。不要装得太满。琼脂糖变硬之前，与昆虫引脚的最后一分钟的调整。 井旁边放置一个编号的纸张样本标签和安全用琼脂糖小降。 每个标本以及重复步骤6至10。 如果所需的图像校准，插入一张纸，印刷微米尺度（ 例如 ， http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/）到一个空井的 ​​底部。井底拼合的文件和温暖琼脂糖覆盖。 所有的标本都嵌入后，将凝胶表面不规则，硬化滴琼脂糖。凝胶放置在一个平面上，轻轻地在融化的琼脂糖额外倒，直到上表面均匀。使用量最小的琼脂糖必要获得一个光滑的表面;太多琼脂糖晦涩的透射光摄影。允许此顶层变硬。 凝胶可以被拍下立体显微镜记录每个barbel对大体形态的阶段。图像校准是通过拍摄嵌入式微米尺度。 可以存储整个凝胶包裹在湿纸巾，并在几个星期在4 °塑料袋密封。 作进一步的分析，可以对触须包含匹配的琼脂块切出的凝胶，用手术刀或刀片和石蜡组织学处理，或由3,4标准方法cryosectioning。另外，个体触须可以被解剖的琼脂糖细的针头，在水冲洗，和其他下游应用（ 例如，整个安装的免疫组织化学或激光共聚焦显微镜）处理。

Discussion

斑马鱼的上颌barbel是一个未充分利用的研究在斑马鱼的几种类型的细胞的生长，保养，并再生的组织系统。 barbel附属物虽然没有人类的模拟，它包含的细胞类型是高度保守的，从而有可能研究皮肤，腺体，黑色素细胞，循环系统血管和神经在光学明确和解剖学简单的圆柱形结构。 barbel组织类似的研究尾鳍，可诱发再生截肢。作为解剖标志的使用边界上颌骨，截肢平面，可以精确地放在促进barbel再生测量。对于一个有经验的运营商，每次手术只需要几秒钟。恢复是快速的，和我们迄今发现鱼的行为没有短期或长期的影响。一个上颌barbel游泳的斑马鱼，吃和繁殖作为有效的非手术控制，并具有可比性的生存组织收集的时间，最长6个月后手术。这种手术的生理影响的预测是微乎其微，因为：1）口外的口味进行芽的barbel还发现其他许多地方，鱼的上皮细胞^，包括嘴唇，脸颊和头5， 2）与众不同的味蕾上出现在72小时内再生barbel（勒克莱尔等 ，未发表数据）。这使得上颌barbel微创系统，为研究伤口愈合，在成年脊椎动物中的心肌血运重建术，和再支配。

手术诱导再生后，触须可以收集的时间间隔形态测量和/或固定组织的微观分析。为方便起见，上颌barbel大约是一个斑马鱼胚胎的长度（2-3毫米）和直径（100-200毫米），促进应用的许多标准协议，包括石蜡组织学，cryosectioning，整个安装的免疫组织化学，和原位杂交。两者合计，这些特点使得上颌barbel高度在体内研究组织的修复和再生模式是可行的。

Materials

Microscope Equipment

A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding.

Barbel Clipping

• Fish system water
• 2 zebrafish crossing tanks
• MS-222 (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate; Sigma Chemical #E10521-10G)
• sterile 120-mm Petri plate
• wet paper towels
• blunt metal spatula
• Dumont #55 Bio Inox Forceps (Fine Science Tools #11255-20)
• Mini-Vannas spring scissors (Fine Science Tools #15000-00)
• methylene blue antifungal agent (Drs. Foster & Smith #CD-905781)
• small aquarium fishnet

Tissue collection and agar embedding

• 4% paraformaldehyde in 1x phosphate-buffered saline (PF-PBS), aliquoted into 50 mL conical tubes and stored frozen at -20°C until use
• 1x phosphate-buffered saline (pH 7.27-6)
• 250 mL glass flask
• 2% agarose in distilled water
• standard small agarose gel electrophoresis rig (gel size = ~10 cm square)
• small-toothed electrophoresis sample comb (comb size 4 x 1.5 mm)
• warm water bath (50-60°C)
• laboratory tape
• black enameled insect pins, size 000 (Fine Science Tools #26000-25)
• 1-2 pin holders (Fine Science tools #26016-12)
• 9-inch glass Pasteur pipette
• pipette bulb or pump
• laboratory tissue
• small paper labels
• (optional) printed calibration scale
• wet paper towels
• zip-closure plastic bag
• scalpel/razor blade (to cut out agar blocks)