ゼブラフィッシュ上顎バーベルの研究のための方法

Summary

ゼブラフィッシュ上顎バーベルは外胚葉、中胚葉および神経堤誘導体を含有する皮膚感覚器官です。重要なのは、大人のバーベルは、近位切断後に再生成することができます。このビデオでは、上顎バーベルの開発を紹介し、バーベルの標本の収集、埋め込みと下流のイメージングに続く再生を誘導するために外科的プロトコルを、示しています。

Abstract

Barbelsは魚類、爬虫類と両生類に見られる皮膚感覚の付属です。ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは 、barbels短鼻ペアと長い上顎ペアの2つのペアを開発しています。バーベルの組織は、皮膚細胞、腺、味覚、メラノサイト、循環血管や知覚神経を含む外胚葉、中胚葉および神経堤由来の細胞が含まれています。ほとんどの成人の組織とは異なり、上顎バーベルは、私たちはライフサイクル全体にわたってこれらの組織型の開発と保守を視覚化できるように、光学的に透明です。

このビデオでは、上顎バーベル（約1ヶ月後の受精を開始）の早期開発を示し、成人心耳（> 3ヶ月後の受精）の再生を誘導するために外科的プロトコルを示しています。簡単に言えば、麻酔魚の左上顎のバーベルは、上顎の尾側端のすぐ遠位滅菌ピンセットで上昇している。罰金、滅菌春のはさみ切断面のための解剖学的ランドマークを確立、このレベルでバーベルのシャフトをカットする鉗子に対して位置決めされる。再生成長は、と反対バーベルと比較してこの平面を基準にして測定することができます。バーベルの組織は、損傷の2週間以内に最大の再生に達し、急速に再生成されます。

再生バーベルを分析するためのテクニックは、標準的なDNAの電気泳動ゲルのウェル中で（再生成および制御）barbelsのマッチドペアを解剖し、埋め込む含まれています。埋め込まれた検体は、便利な総形態と形態計測のための実体顕微鏡下で写真撮影されている、と前のパラフィン組織学のようなダウンストリームアプリケーションに週間保存することができる、cryosectioning、および/または全体のマウント免疫組織化学。これらのメソッドは、ゼブラフィッシュの遺伝学的文脈の中で複数の細胞型の再生能力を研究するための生体組織系の小説として上顎バーベルを確立する。

Protocol

ゼブラフィッシュの飼育ゼブラフィッシュは、標準的な方法1に従って収容し、飼育されています。後期幼虫期間を過ぎて、ゼブラフィッシュの発生段階は、尾鰭（posteriormost hypuralプレート）のベースに上唇のanteriormost点から、その標準的な長さ（SL）、またはミリメートルの直線距離で測定することができる2。約一ヶ月後の受精（10〜12ミリメートルSL）で、鼻腔と上顎barbelsはそれぞれ、嗅覚ピットに近いと上顎の後方の角の透明上皮芽として表示されます。ゼブラフィッシュが成熟するにつれ、barbelsは狭い、ウィスカー状付属物に拡張する。上顎バーベルが大きい（2-3 mm）と、操作が簡単なので、我々のプロトコルは、この特定の付属物に適用され、同様の手法は、しかし、小さな鼻のバーベルに適合させることができる。 バーベルクリッピングシステムの水のpHを7.0にバッファリング（3 -アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸）0.015％MS – 222に浸漬することにより、目的の段階（ 例えば 。、1.5〜2.5センチメートルSL、〜3-6ヶ月後の受精）で成人のゼブラフィッシュをAnaesthetize。水泳運動が停止するまで観察し、鰓の換気は、ゆっくりと規則的になります。魚のサイズに応じて、完全な麻酔が約2〜5分かかります。 水族館魚網を使用して、シャーレ内ウェットペーパータオルの折り返し部分に時間で1〜3の魚を移す。鈍いスパチュラを用いて、向きの魚たちがお互いと左側側面上に平行になるように。手順の実行中に皮膚と鰓の潤いを保つために、最大蓋にボディ全体をカバーする魚、（鰓がカバーする）の尾部上にウェットペーパータオルの倍の一部。 頭部を照らすために、低角度入射光を使用して、実体顕微鏡下でペトリ皿を見る。上顎の後部腹側の角（図1）から突出左上顎バーベル、の基盤に焦点を当てる。 図1。 しっかりと上顎の端に少し遠バーベルのシャフトを把握する。バーベルのシャフトを高めると鉗子の近位先の細いバネはさみの顎を挿入する。はさみは、安定性のための鉗子に触れることができます。最先端の上顎の端に近づくまで、バーベルのシャフトに沿ってハサミの顎をスライドさせます。バーベルのシャフトを介してカットするはさみを閉じます。切断されたバーベルは、依然として、鉗子で把持固定またはさらなる観察のために取り外すことができます。 すぐに表在性真菌感染を制御するために、メチレンブルーの一滴を含むクリーンなシステムの水（〜500ml）の小さな水槽に魚を移す。魚が一晩回復することができます。翌朝、飼育システムに魚を戻す。バーベル再生には、2週間後に最大となる。 マッチドバーベルペアの寒天埋め込み適切な安楽死法による魚を収集し、4℃で一晩攪拌しながら緩衝生理食塩水（PBS）、4％の50 mlチューブパラホルムアルデヒド – リン酸に修正。固定量は、組織の少なくとも10倍のボリュームでなければなりません。固定後、承認された容器にパラホルムアルデヒド廃棄物を処分し、PBSの、いくつかの変更で徹底的に組織をすすいでください。 250mLのガラスフラスコに蒸留水で2％アガロース（T M〜37℃）150mLのを準備します。完全に溶けるまで電子レンジやホットプレートで熱は、定期的にかき回す。 50〜60℃の水浴中で融液を平衡化させます。 しっかりとバッファーチャンバーの側面に対して、小さなガスケットゲルの金型を（〜100mLのゲル体積10 × 10cm）に配置することにより、標準的なゲル電気泳動のリグを組み立てます。 2月4日、小歯サンプル櫛（4 × 1.5 mm）を追加します。 レベルの表面に、非常に浅い井戸を形成し、ちょうど櫛のベースをカバーするために鋳型に溶けたアガロースを注ぐ。すぐに温水浴中に残ってアガロースを戻す、これは組織を（9-12ステップ）を埋め込むために後で使用されます。アガロースと同じ温度にピペットを保つためにフラスコに長いガラスパスツールピペットを置く。 20〜30分硬化にゲルを許可する。櫛を削除し、バッファーチャンバーから硬化ジェルを含むゲルの金型を削除します。ゲルの外にスライドしないようにしっかりと研究室のテープとゲル型のオープンサイドをテープ。追加のアガロースは（ステップ13）後で追加できるように、このテープは、アガロースの表面上に数mmを拡張する必要があります。 実体顕微鏡のステージ上でゲルの金型を置きます。空井戸を拡大し、フォーカスに端をもたらす。 ウェルに隣接アガロースの表面に、水または固定バーベルの標本（ 例えば、再生成および制御）を含む緩衝液の滴をピペット。 USIngは、虫ピンを曲げて井戸に湿った標本をドラッグし、一番下にプッシュ。オリエントは、バーベルシャフトの互いに平行と同様の反対側の長辺に対して位置合わせ。表面張力は、位置で組織を保持するのに役立ちます。 ときに埋め込むことができ、微細なピ​​ペットチップまたは井戸から余分な水分を除去するために実験室の組織の角を使用。組織が乾燥させないようように迅速に働く。 温められたガラスパスツールピペットを用いて、軽く場所にバーベルの組織をシールするために標本とその周辺で新鮮な溶融アガロースをピペット。入れすぎないでください。アガロースが固まる前に、虫ピンで土壇場の調整を行う。 よく隣の番号の紙標本のラベルを配置し、アガロースの小さなドロップで固定します。 繰り返します標本の各ウェルのために6〜10を繰り返します。 画像のキャリブレーションのために必要に応じて、印刷されたマイクロメートルのスケール（ 例えば、と一枚の紙を挿入http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/空井戸の底に）。井戸の底に紙を平らにし、暖かいアガロースをかぶせます。 標本のすべてが埋め込まれている後に、ゲルの表面は、アガロースの硬化滴で、不規則になります。平らな面にゲルを置き、上面が均一になるまで、ゆっくりと追加の溶融アガロースに注ぐ。滑らかな表面を得るために必要なアガロースの最小量を使用して、あまりにも多くのアガロースは、透過光撮影を不明瞭になります。硬化するために、この最上層を許可する。 ゲルは、今や各バーベルのペアの総形態を記録するために実体顕微鏡のステージ上で撮影することができます。画像のキャリブレーションは、埋め込まれたマイクロメートルのスケールを撮影することによって得られる。 ゲル全体がぬれたペーパータオルに包んで数週間、4℃でビニール袋に密封し保存することができます。 詳しい解析方法については、barbelsのペアを含む寒天ブロックはメスまたはカミソリ刃でゲルから切り出しすることができ、パラフィン組織学用に処理または標準的な方法3,4でcryosectioning。また、個々のbarbelsは、微細な針でアガロースから解剖し、水ですすぎ、および他のダウンストリームアプリケーション（ 例えば、ホールマウント免疫組織化学または共焦点顕微鏡）用に処理することができます。

Discussion

ゼブラフィッシュ上顎バーベルは、ゼブラフィッシュのいくつかの種類の細胞の成長、維持、および再生を研究するために活用されていない組織のシステムです。バーベルの付属物がない人間のアナログを持っていないが、それに含まれる細胞の種類は非常にそれが可能な光学的に透明と解剖学的にシンプルな円筒状の構造体の皮膚、腺、メラノサイト、循環血管や神経を研究すること、保存されている。よく研究さ尾鰭と同様に、バーベルの組織は切断によって再生するために誘導することができる。解剖学的ランドマークとして、上顎の境界線を使用して、切断面は、バーベル再増殖の測定を容易に、正確に配置することができます。経験豊富な演算子の場合は、それぞれの手術は数秒しかかかりません。回復は急速であり、我々はこれまで、魚の動作には短期または長期的な影響を検出されている。手術後6ヶ月に1上顎バーベルを泳いでゼブラフィッシュ、非外科的コントロールとして食べると効果的に繁殖し、組織収集の時間に匹敵する生存率を持って、アップ。この手術の生理的影響は、1）バーベルに運ば口外味蕾がまた唇、頬およびヘッド⁵を含む魚の上皮の他の多くの部分、上で検出されているため、最小限であると予測、2）差別味蕾が上に表示されます72時間以内に再生成バーベルは（ルクレールら 、未発表データ。）これは、上顎バーベル大人の脊椎動物のコンテキスト内で創傷治癒、血行再建術、および神経再生を研究するための低侵襲システムです。

再生の外科的誘導した後、barbelsは形態学的測定および/または固定した組織の顕微鏡分析のための間隔で収集することができます。便利に、上顎バーベルはcryosectioning、ホールマウントの免疫組織化学、およびin situで 、パラフィン組織学を含む多くの標準プロトコルのアプリケーションを容易に、約長さ（2-3 mm）とゼブラフィッシュ胚の直径（100〜200 mm）ですハイブリダイゼーション。一緒に、これらの機能は、上顎バーベル組織修復および再生を研究するためのin vivoモデルにおいて高度に実現可能にします。

Materials

Microscope Equipment

A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding.

Barbel Clipping

• Fish system water
• 2 zebrafish crossing tanks
• MS-222 (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate; Sigma Chemical #E10521-10G)
• sterile 120-mm Petri plate
• wet paper towels
• blunt metal spatula
• Dumont #55 Bio Inox Forceps (Fine Science Tools #11255-20)
• Mini-Vannas spring scissors (Fine Science Tools #15000-00)
• methylene blue antifungal agent (Drs. Foster & Smith #CD-905781)
• small aquarium fishnet

Tissue collection and agar embedding

• 4% paraformaldehyde in 1x phosphate-buffered saline (PF-PBS), aliquoted into 50 mL conical tubes and stored frozen at -20°C until use
• 1x phosphate-buffered saline (pH 7.27-6)
• 250 mL glass flask
• 2% agarose in distilled water
• standard small agarose gel electrophoresis rig (gel size = ~10 cm square)
• small-toothed electrophoresis sample comb (comb size 4 x 1.5 mm)
• warm water bath (50-60°C)
• laboratory tape
• black enameled insect pins, size 000 (Fine Science Tools #26000-25)
• 1-2 pin holders (Fine Science tools #26016-12)
• 9-inch glass Pasteur pipette
• pipette bulb or pump
• laboratory tissue
• small paper labels
• (optional) printed calibration scale
• wet paper towels
• zip-closure plastic bag
• scalpel/razor blade (to cut out agar blocks)