L'isolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)

Summary

Protocol

Total préparation de moelle osseuse

1. Quatre souris B6 sont sacrifiés et disséqués pour obtenir des tibias, des fémurs, de la hanche et du rachis.
2. Pendant les dissections, les membres et les os sont conservés dans du PBS à 2% de FCS inactivé par la chaleur (optionnel EDA 2mm - support de dissection).
3. Les os propres sont écrasées au mortier et un pilon dans un milieu de dissection. Une façon efficace de le faire est d'écraser les tibias, fémurs et les hanches de chaque souris, puis 2 épines à la fois.
4. Le mélange de cellules issues de chaque souris est séparée et filtrée à travers un filtre 40μm dans un tube de 50ml Falcon. De cette façon, chaque tube contenant le mélange de cellules obtenues sur l'ensemble des os de la jambe d'une souris, et la moitié du mélange obtenu à partir de 2 épines. A ce stade, le filtre est utilisé pour séparer les débris osseux.
5. Il est généralement conseillé d'écraser les os de la jambe deux fois pour obtenir du blanc (sans la moelle osseuse) des fragments d'os, et les fragments colonne vertébrale 2 ou 3 fois.
6. Remplir les tubes de les avoir équilibré, et de spin 5 min 1200rpm.
7. Aspirer le surnageant et desserrer le culot en faisant glisser les tubes sur la grille du tube (cette étape est importante après chaque centrifugation pour minimiser la formation de bouquet et de la perte de cellules). Resuspendre chaque tube dans une FCS ml de PBS à 2% (pas d'EDTA à partir de maintenant) si vous faites l'épuisement lignée, ou dans tout autre volume est pratique pour vous.

Déplétion Lineage

1. Cette procédure vous permet d'éliminer des cellules hautement différenciées et d'obtenir une population très hétérogène de cellules, enrichies en cellules souches et progénitrices. Si vous êtes le tri HSC, cette étape permet de réduire drastiquement le nombre de cellules qui ont à passer par le tri cellulaire, réduisant ainsi le temps de tri et vous permettant de trier HSC d'un plus grand nombre de souris, de sorte que vous pouvez obtenir un plus grand nombre de HSC dans un tri unique.
2. Si vous allez à trier plus tard, sortez du mélange de cellules 50 pl (j'ai l'habitude de prendre un peu de chaque tube) pour le tri des contrôles (sans tache et SCA1, c-Kit, CD48, FLK2 contrôles de couleur unique).
3. Ajouter 30ml/tube cocktail de Lin. Cocktail de Lineage contient une variété d'anticorps, ce qui change malheureusement un peu d'un laboratoire à. Dans le laboratoire Scadden, nous utilisons des anticorps contre le biotinilés Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. Leur dilution finale de la coloration est 1:700.
4. Vortex rapidement pour mélanger, et laisser incuber pendant 15 min à 4 ° C.
5. Durant l'incubation, préparer les colonnes sur les aimants et les tubes d'élution 15ml sous les colonnes. Degas certains PBS en utilisant un filtre steriflip (vous devriez voir des bulles d'air peu s'oriente vers la surface de la cause de l'aspiration du PBS), et d'équilibrer les colonnes par l'application de 3ml dégazé PBS dans chaque colonne.
6. Le débit de la colonne est d'environ 1ml/5min, donc il faut environ 15 min pour avoir les colonnes prêtes à l'emploi.
7. A la fin de l'incubation, ajouter 2% de FCS PBS pour remplir les tubes et centrifuger pendant 5 min à 1200rpm.
8. Aspirer le surnageant, desserrez les boulettes et remettre en suspension dans 1 ml / tube dégazé PBS.
9. Si vous êtes le tri plus tard, sortez la moelle osseuse totale seule lignée coloration couleurs Ctrl (15ml, un peu de chaque tube).
10. Ajouter streptavidine 30ml/tube perles, vortex rapidement pour mélanger, et laisser incuber pendant 15 min à 4 ° C.
11. A la fin de l'incubation, ajouter 2 ml / tube de dégazage du PBS. Mettez les tubes de prélèvement de nouveau sous les colonnes, et d'appliquer chaque suspension d'une colonne, filtrant à travers un filtre 40μm.
12. Ajouter une autre de 3 ml d'dégazé PBS dans chaque tube pour le laver. Une fois les colonnes sont vides, appliquer à nouveau en utilisant le même filtre 40μm.
13. L'éluat contient le mélange de cellules lignée appauvri, une population hétérogène enrichi pour les cellules souches et progéniteurs. Piscine du contenu des 4 tubes en 2 tubes. Spin pendant 5 min à 1500rpm.
14. Aspirer le surnageant. Le culot doit être blanc ou principalement blanc. Desserrer les boulettes et les remettre en suspension ensemble dans 1ml de PBS totale FCS 2% si vous êtes le tri plus tard, sinon remettre en suspension dans tout le volume est pratique pour vous.

LKS ou à long terme, le tri HSC

1. Sortez la lignée appauvri seule coloration couleurs Ctrl (15ml). Cela vous permettra d'évaluer l'efficacité de votre épuisement lignée.
2. Le mélange de cellules à trier est taché dans le tube de 15ml.

Ajouter anticorps:

Sca PE-Cy5.5	1: 100	10ml
Kit APC	1:100	10ml
SA PE-Cy7	1:500	2ml

Pour trier à long terme, HSC, ajoutez aussi:

CD48 FITC	1:1000	1ml
FLK2 PE	1:200	5ml

Aussi, préparez coloration simple contrôle à l'aide de la moelle osseuse totale mis de côté après la dissection et l'tachés de moelle osseuse totale de lignage. Ces colorations peuvent être effectuées directement dans les tubes FACS.

Assurez-vous d'être dans le noir!

1. Vortex rapidement pour mélanger et incuber à 4 ° C pendant 20 à 30 minutes, à mi-chemin re-mélange à travers.
2. Pour laver l'excès d'anticorps, remplir les tubes avec du PBS à 2% de FCS et de spin pendant 5 min à 1500 rpm.
3. Retirer le surnageant, resuspendre toutes les pastilles et les déplacer vers de nouveaux tubes FACS avec des bouchons de filtre. Il pourrait prendre un certain temps pour obtenir des cellules à passer par ces filtres, et il est important d'appliquer un peu plus tard PBS pour laver le filtre et de minimiser la perte de cellules. Cette étape est nécessaire pour éviter le colmatage de la trieuse, qui est le pire cauchemar de tout utilisateur trieur de cellules.
4. Lors de la remise sur vos cellules à l'installation de tri cellulaire, assurez-vous également de préparer un tube avec du PBS 10% SVF HI où les cellules seront collectées.
5. Si vous êtes le tri des cellules LKS, vous obtiendrez une population hétérogène contenant à long terme et court terme repeupler progéniteurs HSC et multipotentes. Un rendement moyen est de 300 000 LKS de 4 souris.
6. Si vous avez également utilisé CD48 et FLK2 anticorps, vous pouvez séparer chaque population de HSC à long terme, HSC à court terme et MPP. LT-HSC sont les populations les plus rares. Un rendement moyen est d'environ 50.000 à 60.000 cellules de 4 souris.