Engineering zellpermeablen Protein

Summary

Protein Transduktion ermöglicht die direkte Abgabe von biologisch aktiven Proteinen in Zellen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden wie DNA-Transfektion oder virale Transduktion dieser nicht-invasiven Paradigma ermöglicht hoch effiziente zelluläre Manipulation in eine titrierbare Weise umgehen zelluläre Toxizität und das Risiko der onkogenen Transformation durch permanente genetische Veränderung.

Abstract

Das Protein Transduktion Technik ermöglicht die direkte Abgabe von biologisch aktiven Materials in Säugerzellen [zur Übersicht siehe ^1,2]. Für diese Verwendung des translozierenden Fähigkeit der sogenannten Zell-penetrierende Peptide (CPP) machen kann, auch als Proteintransduktionsdomänen (PTDs) bezeichnet. Das TAT-CPP aus dem humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) Tat (trans-Aktivator der Transkription)-Protein wurde in großem Umfang eingesetzt abgeleitet. Die positiv geladenen TAT fördert Zellpermeabilität damit die Überwindung der Barrieren der Zellmembran durch Endozytose und / oder direkte Membranpenetration ^2. In Kombination mit einem Kernlokalisierungssignal (NLS) Fusionsproteine ​​sind in der Lage, den Kern aufweisen Funktionalität geben. Unsere Video-Präsentation demonstriert, wie eine Veranschaulichung für das Engineering von zellpermeablen Proteine, die Konstruktion, Produktion und Anwendung eines zellpermeablen Version des DNA-modifizierende Enzyme Cre.

Cre ist eine ortsspezifische Rekombinase, die in der Lage zu erkennen und zu rekombinieren 34 Basenpaar loxP-Stellen in Säugetierzellen in vitro und in vivo ist. Deshalb ist die Cre / loxP-System ist weit verbreitet bedingt induzieren Mutationen im Genom lebender Zellen ^3,4. Die Lieferung von aktiven Cre-Rekombinase zu Zellen, stellt jedoch eine Einschränkung.

Wir beschreiben die pSESAME Vektor-System, das eine direkte Insertion des Gens-of-Interest können und bietet eine Plattform, um schnell Klon unterschiedlichen Domänen und-Tags innerhalb des Vektors in eine komfortable und standardisierte Art und Weise verwendet. Umstellen der verschiedenen tags wurde gezeigt, dass die biochemischen Eigenschaften der Fusionsproteine ​​bietet die Möglichkeit, höhere Ausbeute und bessere Löslichkeit zu erreichen ändern. Wir zeigen, wie zu äußern und zu reinigen rekombinanten Zell-Permeationsmittel Proteine ​​in und aus E. coli. Die Funktionalität des rekombinanten Proteins ist Cre schließlich in der Zellkultur durch die Bewertung ihrer intrazellulären Rekombinase-Aktivität geprüft.

Protocol

Bau von Expressionsvektor und Ausdruck: Die pSESAME-Cre Expressionsvektor wurde durch Einfügen eines Cre-encoding-Fragment in pSESAME über AvrII und NheI-Restriktionsstellen mit Standard-Klonierungsverfahren konstruiert. pSESAME kodiert für ein Fusionsprotein, bestehend aus einem Histidin-Tag, TAT-Domäne, NLS-Sequenz und Cre, abgekürzt HTNCre. Für die Expression von HTNCre die pSESAME-Cre wurde in TUNER (DE3) Placi umgewandelt und verwendet, um eine Glycerin Lager vorzubereiten. Eine Über-Nacht-Kultur beimpft mit einer Pipettenspitze mit transformierten Bakterien aus dem Glycerin Lager beschichtet. Die Über-Nacht-Kultur bestand aus LB-Medium mit 0,5% Glucose [v / v] und Carbenicillin in einer Endkonzentration von 50 ug / mL und durfte bei 37 ° C wachsen für 16 Stunden. Am nächsten Tag dicht gewachsen über Nacht Kultur wurde verwendet, um den Ausdruck Kultur bei einem Verhältnis von 1 bis 40 zu impfen und wurde in einem Brutschrank bei 37 ° C stellen Expression Kultur bestand aus TB-Medien mit 0,5% Glucose [v / v] und Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 ug / ml ergänzt. Bei einer OD 595 von 1.5 die Expression Kultur wurde mit 0,5 mM IPTG für 1 h induzierten Anschließend wurden die Bakterien durch Zentrifugation bei 5000 rpm für 10 Minuten in einem SLA3000 Rotor gesammelt. Bakterien-Pellets wurden bei minus 20 ° C bis zur Reinigung gespeichert. Reinigung von zellpermeablen Protein: Gefrorene Bakterien-Pellets wurden in 10 mL Lysispuffer pro Liter Flasche Kultur für 15 Minuten bei Raumtemperatur resuspendiert. Suspension wurde dann mit 1 mg / ml Lysozym für weitere 15 Minuten inkubiert beim Mischen bei Raumtemperatur. 25 U / ml Benzonase wurde später und fügte hinzu, inkubiert beim Mischen für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach Ultraschallbehandlung auf Eis für 1,5 min mit 0,5 s Impulse bei 45% der Leistung, 1 ml kaltem Wein-Salz-Puffer (TSB) pro ml Suspension wurde sorgfältig während zugegeben, die Vermischung und inkubiert für 5 min auf Eis. SDS-PAGE-Probenpuffer Lysat Fraktion (L) aufgenommen wurde. Cleared Lysat wurde durch Zentrifugation bei 4 ° C für 30 min bei 30.000 g erhalten SDS-PAGE-Proben von löslichen (S) und unlöslichen Fraktionen (I) aufgenommen wurden. Der Überstand wurde in frische 50 ml-Falcon-Röhrchen überführt und wurde dann vorsichtig für 1 h bei 4 ° C gemischt mit 2 ml 50% Ni-NTA Gülle pro Liter ersten Ausdruck Kultur. Die Suspension wurde in ein Fließ EconoPac Spalte (SDS-PAGE Stichprobe von Flow-Through-Fraktion (FT) aufgenommen wurde) verpackt und zweimal mit 5-Bett-Waschpuffer. SDS-PAGE-Proben der beiden Waschfraktionen (W1 & W2) gesammelt wurden. HTNCre-haltigen Fraktionen wurden mit 3-Bett-Elutionspuffer und Probe Eluatfraktion (E) für die SDS-PAGE-Analyse eluiert wurde. Imidazol wurde durch Dialyse Elutionsfraktion gegen hohe Salz-Puffer zweimal entfernt. Die Protein-Lösung wurde durch Dialyse gegen Glycerin-Puffer zweimal konzentriert. In aller Dialysepatienten Schritte das Verhältnis von Puffer zu Probe wurde mindestens 50. Dieses Verfahren führte zu einem Glycerin-Stammlösung enthält HTNCre in einer üblichen Konzentration zwischen 200 und 450 uM, dh 1 Liter Ausdruck Kultur in ~ 12 mg des Proteins führen. Beispiel Glycerin Lager (GS) für die SDS-PAGE-Analyse gesammelt. HTNCre Stammlösung kann bei minus 20 ° C gelagert werden Abbildung 1: SDS-PAGE-Analyse der Proben während des Reinigungsprozesses der Rekombinase Cre gesammelt. Induktion der Cre Expression wird durch dominante Bande in Lysat Bruchteil angezeigt. Obwohl ein Teil des Proteins ist unlöslich das Cre-Protein kann weiter angereichert werden, wie in Eluat und Glycerin Lager Fraktionen gesehen. L: Lysate, I: Unlöslich, S: Überstand, FT: Flow-through, W: Waschen, E: Eluat, GS: Gylcerol Lager. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. Protein Transduktion in murine embryonale Stammzellen (ES-Zellen): ES-Zellen, die eine bedingte β-Galactosidase-Reporter 5. Konstruieren Sie wurden als einzelne Zellen mit Hilfe TrypLE ™ Express für die Dissoziation von anhaftenden Zellen ausgesät. Nach 4 bis 6 Stunden wurden die Zellen hatten wieder angebracht und das Medium wurde entfernt. Anschließend ES-Zellen wurden mit HTNCre-haltigem Medium für 16 Stunden inkubiert. Eine entsprechende Menge HTNCre Protein (entspricht 10 nM) aus dem Glycerin Lager wurde in ES-Medium und anschließend sterilfiltriert (0,22 um) verdünnt. Nach Proteintransduktionsdomäne Medium wurde wieder auf das normale Wachstum Medium gewechselt. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 Minuten. Zwei zusätzlichezusätzliche Waschschritte mit PBS wurden hingerichtet, bevor X-Gal-Färbung durchgeführt wurde. Fixierten Zellen wurden mit einer Schicht von X-Gal Färbelösung 6 abgedeckt und inkubiert über Nacht bei 37 ° C. Repräsentative Ergebnisse: Am nächsten Tag X-Gal Färbelösung wurde angestrebt und die Zellen wurden mit einer Schicht von PBS für die Mikroskopie Analyse abgedeckt. 80 bis 100% der rekombinierten Zellen konnten in den murinen ES-Zellen durch β-Galactosidase-Aktivität gemessen beobachtet werden.

Discussion

Während des Reinigungsprozesses des Cre-Fusionsprotein ist es wichtig, nicht auf die Zugabe von eiskaltem TBS-Puffer vor dem Zentrifugieren weglassen. Ansonsten Rekombinase Cre tendenziell Niederschlag in der Glycerin-Puffer.

Wenn die Eluatfraktion scheint trüb aufgrund der hohen Konzentration des Fusionsproteins zusätzliche Elutionspuffer sollte hinzugefügt werden, bis die Lösung wieder gelöscht hat.

Die Anwendung von 10 pM Cre-Fusionsprotein führt in der Regel eine Rekombination Effizienz von 80 bis 100%. Fötalem Kälberserum (FCS), ein wichtiger Bestandteil der ES-Zell-Medium stark hemmt Proteintransduktionsdomäne. Deshalb hohe Konzentration von Cre-Rekombinase eingesetzt werden mussten. Bei der Arbeit in serum-freien Bedingungen weniger Protein (0,5 bis 2 M) kann verwendet werden, um ähnliche Rekombination Wirkungsgrade zu erreichen.

Mit dem pSESAME Vektor-System zur Hand kann man die Technik der Proteintransduktionsdomäne an andere Proteine ​​einschließlich Transkriptionsfaktoren wie Oct4 und Sox2 ⁷ und ⁸ gelten Scl/Tal1.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
TUNER (DE3) pLacI		Novagen	70625
Glycerol		Carl Roth	3783.2
Na2HPO4		Roth	T876.1
Trizma Base		Sigma-Aldrich	T1503
HCl		Roth	4625.1
Imidazol		Roth	X998.4
NaCl		Roth	9265.2
Yeast Extract		Roth	2363.4
Trypton/Pepton		Roth	8952.4
K2HPO4		Roth	P749.2
KH2PO4		Roth	3904.1
Ampicillin		Sigma	A9518
Carbenicillin		Sigma	6344.2
HEPES		Sigma	H3375
Lysozyme		Sigma	62971
Benzonase		Novagen
L-Tartaric acid, disodium salt		Sigma
50% Ni-NTA slurry		Invitrogen	R901-15
EconoPac columns		Biorad	732-1010
Sterile filter 0,22μm		Whatman
Paraformaldehyde (PFA)		Sigma
LB medium				Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl
TB medium				Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4
Lysis Buffer				50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8
Tartaric Salt Buffer (TSB)				PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol
Washing Buffer				PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol
Elution Buffer				PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol
High Salt Buffer				600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
Gylcerol Buffer				50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
TrypLE™ Express		Invitrogen
ESGRO (LIF)		Millipore
NEAA		Gibco	11140035
L-Glutamin		Gibco	25030024
β-Mercaptoethanol		Gibco	31350010
DMEM		Gibco	11960044
PBS		Gibco
Fetal Calf Serum (FCS)		PAA
X-Gal staining solution:				4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS
K3(FeIII(CN)6)		Sigma	P-3367
K4 (FeII(CN)6)		Sigma	P-9387
MgCl2		Sigma	M8266
X-Gal		Sigma	B4252