הנדסה Cell-חדיר חלבון

Summary

התמרה חלבון ומאפשרת העברה ישירה של חלבונים פעילים ביולוגית לתוך התאים. בניגוד לשיטות קונבנציונליות כגון transfection DNA נגיפי או התמרה זו פרדיגמה פולשנית מאפשרת מניפולציה הסלולר היעילה ביותר באופן titratable עקיפת רעילות הסלולר את הסיכון של שינוי בשעור על ידי הנדסה גנטית קבע.

Abstract

הטכניקה התמרה חלבון ומאפשרת העברה ישירה של החומר הפעיל מבחינה ביולוגית לתוך בתאי יונקים [לבדיקה לראות ^1,2]. עבור אחד זה יכול לעשות שימוש ביכולת translocating של המכונים פפטידים בתא החודר (CPPs), המיועד גם התמרה תחומים חלבון (PTDs). TAT-CPP נגזר סוג נגיף הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) תאת (טרנס activator של שעתוק) חלבון כבר בשימוש נרחב. תאת חיובי ומקדם חדירות התא ובכך להתגבר על מחסומים של קרום התא על ידי אנדוציטוזה ו / או חדירה קרום ישיר ^2. בשילוב עם אות לוקליזציה גרעיני (NLS) חלבונים היתוך מסוגלים להיכנס פונקציונליות גרעין בתערוכה. מצגת וידאו שלנו מוכיח, כמו הדגמה של הנדסה של התא חדיר חלבונים, הבנייה, ייצור ויישום של גרסת התא חדיר של שינוי ה-DNA אנזים Cre.

Cre הוא recombinase אתר ספציפי כי הוא מסוגל לזהות recombine 34 זוג בסיס אתרי loxP בתאי יונקים במבחנה in vivo. לכן מערכת Cre / loxP נעשה שימוש נרחב על תנאי להשרות מוטציות בגנום של תאים חיים ^3,4. מסירת פעיל Cre recombinase לתאים, לעומת זאת, מהווה מגבלה.

אנו מתארים את מערכת וקטור pSESAME, המאפשר החדרה ישירה של הריבית גנים של מספק פלטפורמה במהירות שיבוט תחומים שונים ותגי בשימוש בתוך וקטור בצורה נוחה סטנדרטית. סידור מחדש של תגים שונים הוכח כדי לשנות את המאפיינים הביוכימיים של חלבונים היתוך מתן אפשרות להשיג תשואה גבוהה יותר מסיסות טובה יותר. אנו מדגימים כיצד לבטא ולטהר רקומביננטי התא permeant חלבונים מ החיידק. הפונקציונליות של החלבון Cre רקומביננטי הוא תוקף בסופו של דבר על ידי הערכת הפעילות recombinase תאיים בתרבות התא.

Protocol

בנייה של וקטור הביטוי הביטוי: וקטור pSESAME-Cre ביטוי נבנה על ידי הוספת קטע Cre קידוד לתוך pSESAME דרך אתרי AvrII ו NheI הגבלה באמצעות שיטות שיבוט סטנדרטיות. pSESAME מקודד חלבון איחוי המורכב תג-היסטידין, TAT-תחום, רצף NLS ו Cre, מקוצר HTNCre. עבור ביטוי HTNCre pSESAME-Cre הפך (DE3) TUNER pLacI ומשומשים להכין מלאי גליצרול. תרבות על הלילה היה מחוסן באמצעות קצה pipet מצופה חיידקים הפך ממלאי גליצרול. תרבות הלילה מעל כללה התקשורת LB בתוספת גלוקוז 0.5% [v / v] ו carbenicillin בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו הורשה לגדול ב 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. למחרת גדל בצפיפות יתר לילה תרבות שימש לחסן את התרבות ביטוי ביחס של 1 עד 40 ו הושם באינקובטור ב 37 ° C. תרבות הביטוי כללה התקשורת TB בתוספת גלוקוז 0.5% [v / v] ו אמפיצילין בריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל. ב OD 595 של 1.5 תרבות הביטוי היה מושרה עם IPTG 0.5 מ"מ 1 ח כתוצאה מכך חיידקים נאספו על ידי צנטריפוגה בסל"ד 5000 למשך 10 דקות בתוך הרוטור SLA3000. כדורי חיידקים היו מאוחסנים בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לטיהור. טיהור של חלבון התא חדיר: חיידקים קפואים כדורי היו resuspended במאגר מ"ל 10 תמוגה לכל תרבות בקבוק ליטר במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השעיה הודגר אז עם ליזוזים מ"ג / מ"ל ​​1 במשך 15 דקות נוספות תוך ערבוב בטמפרטורת החדר. 25 U / mL benzonase נוספה לאחר מכן מודגרות תוך ערבוב במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר sonification על קרח דק 1.5 עם פולסים של 0.5 ב 45% של הכוח, 1 מ"ל מלח קר חיץ טרטרית (TSB) לכל מ"ל ההשעיה נוספה בקפידה תוך ערבוב במשך 5 דקות מודגרות על הקרח. SDS-PAGE מדגם של חלק lysate (L) נלקח. Lysate פינה הושג על ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב 30,000 g. SDS-PAGE דוגמאות של שברים מסיסים (S) מסיסים (אני) נלקחו. Supernatant הועבר לתוך צינורות טרי 50 מ"ל בז והיה מעורב אז בעדינות במשך שעות 1 על 4 ° C עם 2 מ"ל של 50% Ni-נ.ת. ע slurry לליטר של תרבות הביטוי הראשוני. ההשעיה היה דחוס לתוך טור זרימת הכבידה EconoPac (SDS-PAGE מדגם של זרימה דרך שבריר (FT) נלקח) ורחץ פעמיים עם 5 למיטה כרכים של חיץ כביסה. SDS-PAGE דגימות של שני שברים כביסה (W1 & W2) נאספו. HTNCre המכילים שברים היו eluted עם 3 המיטה כרכים של חיץ elution מדגם של חלק eluate (ה) לצורך ניתוח SDS-PAGE נלקח. Imidazole הוסר על ידי dialyzing חלק elution נגד המאגר מלח גבוה פעמיים. הפתרון חלבון היה מרוכז יותר על ידי dialyzing נגד המאגר גליצרול פעמיים. בכל השלבים דיאליזה יחס חיץ המדגם היה לפחות 50. הליך זה הביא לפתרון גליצרול המכיל מניות HTNCre בריכוז הרגיל בין 200 ל 450 מיקרומטר, כלומר, 1 ליטר של תרבות הביטוי תגרום ~ 12 מ"ג של חלבון. דוגמאות של מניות גליצרול (GS) לניתוח SDS-PAGE נאסף. פתרון HTNCre המניות יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורה של מינוס 20 ° C. איור 1: SDS-PAGE ניתוח של דגימות שנאספו במהלך תהליך טיהור Cre recombinase. אינדוקציה של ביטוי Cre הוא הצביע על ידי הלהקה הדומיננטי חלק lysate. אמנם חלק של החלבון היא חלבון מסיס Cre ניתן להעשיר עוד יותר כפי שניתן לראות eluate ומלאי שברים גליצרול. L: lysate, אני: מסיסים, S: Supernatant, FT: זרימה דרך, W:, E כביסה: Eluate, GS: במלאי Gylcerol. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. חלבון התמרה לתוך Murine גזע עובריים (ES) התאים: תאים ES נושא מותנה β-Galactosidase 5 לבנות הכתב היו זורעים כמו תאים בודדים באמצעות TrypLE ™ Express עבור ניתוק של תאים חסיד. לאחר 4 עד 6 שעות התאים לו מחדש מצורף המדיום הוסר. בהמשך תאים ES הודגרו עם המדיום HTNCre המכילים במשך 16 שעות. כמות נאותה של חלבון HTNCre (המקביל ל 10 מיקרומטר) מתוך המלאי גליצרול היה מדולל לתוך מדיום ES ו filtrated סטרילי לאחר מכן (0.22 מיקרומטר). לאחר התמרה בינוני חלבון שונה בחזרה בינוני צמיחה נורמלית. לאחר שני תאים ימים נשטפו עם PBS וקבוע עם Paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 10 דקות. שני addiצעדים כביסה tional עם PBS הוצאו להורג לפני X-Gal מכתים בוצעה. תאים קבוע היו מכוסים בשכבה של פתרון ה-X גל מכתים 6 וטופחו על הלילה 37 ° C. נציג תוצאות: למחרת X-Gal פתרון מכתים היה שאף והתאים היו מכוסים בשכבה של PBS לניתוח במיקרוסקופ. 8-10% של תאים recombined יכול להיבחן בתוך תאים ES Murine להישפט על ידי פעילות β-Galactosidase.

Discussion

במהלך תהליך טיהור של החלבון היתוך Cre חשוב לא להשמיט את התוספת של חיץ קרח כפות קר לפני צנטריפוגה. אחרת Cre recombinase נוטה לשקוע בתוך למאגר גליצרול.

אם חלק eluate מופיע להיות עכורים בשל ריכוז גבוה של חלבון חיץ היתוך elution נוספים יש להוסיף עד לפתרון פינתה שוב.

היישום של 10 מיקרומטר של חלבון היתוך Cre בדרך כלל התוצאות יעילות רקומבינציה של 80% עד 100. עוברית עגל סרום (FCS) להיות מרכיב מרכזי של המדיום הסלולרי ES מאוד מעכב חלבון התמרה. לכן ריכוז גבוה של Cre recombinase היה לשמש. כאשר עובדים בסרום ללא תנאים פחות חלבון (0.5-2 מיקרומטר) ניתן להשתמש כדי להשיג יעילות רקומבינציה דומה.

עם מערכת וקטור pSESAME ב מצד אחד יכול ליישם את הטכניקה של התמרה החלבון לחלבונים אחרים, כולל גורמי שעתוק כגון Oct4 ו Sox2 ⁷ ו – ⁸ Scl/Tal1.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
TUNER (DE3) pLacI		Novagen	70625
Glycerol		Carl Roth	3783.2
Na2HPO4		Roth	T876.1
Trizma Base		Sigma-Aldrich	T1503
HCl		Roth	4625.1
Imidazol		Roth	X998.4
NaCl		Roth	9265.2
Yeast Extract		Roth	2363.4
Trypton/Pepton		Roth	8952.4
K2HPO4		Roth	P749.2
KH2PO4		Roth	3904.1
Ampicillin		Sigma	A9518
Carbenicillin		Sigma	6344.2
HEPES		Sigma	H3375
Lysozyme		Sigma	62971
Benzonase		Novagen
L-Tartaric acid, disodium salt		Sigma
50% Ni-NTA slurry		Invitrogen	R901-15
EconoPac columns		Biorad	732-1010
Sterile filter 0,22μm		Whatman
Paraformaldehyde (PFA)		Sigma
LB medium				Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl
TB medium				Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4
Lysis Buffer				50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8
Tartaric Salt Buffer (TSB)				PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol
Washing Buffer				PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol
Elution Buffer				PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol
High Salt Buffer				600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
Gylcerol Buffer				50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
TrypLE™ Express		Invitrogen
ESGRO (LIF)		Millipore
NEAA		Gibco	11140035
L-Glutamin		Gibco	25030024
β-Mercaptoethanol		Gibco	31350010
DMEM		Gibco	11960044
PBS		Gibco
Fetal Calf Serum (FCS)		PAA
X-Gal staining solution:				4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS
K3(FeIII(CN)6)		Sigma	P-3367
K4 (FeII(CN)6)		Sigma	P-9387
MgCl2		Sigma	M8266
X-Gal		Sigma	B4252