Geautomatiseerde Microfluïdische Blood Lysis Protocol voor de verrijking van circulerende cellen met een kern

Summary

Een geautomatiseerde microfluïdische apparaat werd ontwikkeld voor het doen circuleren kernhoudende cel verrijking uit perifeer bloed via erythrocyten lysis dat de isolatie van hoge kwaliteit staal zorgt zonder cel verlies.

Abstract

In dit rapport het protocol voor een geautomatiseerde microfluïdische bloed lysis apparaat is gedetailleerd. Circulerende cellen met een kern (CNCs), waaronder leukocyten en endotheelcellen, bieden een ideaal platform voor een bijgewerkte status op het immuunsysteem conditie van een individu. De microfluïdische-protocol zorgt voor verrijking van CNCs zonder selectieve celverlies en monstervoorbereiding variabiliteit te wijten aan de gebruiker-gemedieerde stappen. Kortom, het protocol bevat apparaat fabricage, monsterneming, het apparaat instellen en het uitvoeren van bloed door de microfluïdische kamer. Binnen het apparaat vol bloed wordt snel vermengd met gedemineraliseerd water voor ongeveer 10 seconden in een 50 micron x 150 micron microfluïdische kanaal. In deze tijdspanne erytrocyten zijn te wijten aan hypotone voorwaarden gelyseerd. Visgraat-structuren op de bodem van het kanaal zorgen voor de grondige mengen en blootstelling van cellen aan een constante omgeving. Overige cellen worden teruggestuurd naar isotone omstandigheden bij de uitgang van het apparaat, bevestigd met 2% paraformaldehyde, gecentrifugeerd tot erythrocyten puin te scheiden van CNCs, en gesuspendeerd in flow buffer voor kleuring en analyse door flowcytometrie. De resultaten tonen schoon flowcytometrie puntgrafieken met opgeslagen CNC-populaties. Betekenis van dit apparaat en protocol komt in de studie en begrip van de ziekte pathogenese door de analyse van CNC-populaties. Vandaar dat automatisering, effectiviteit, en de eenvoud van de microfluïdische protocol aangetoond.

Protocol

Deel 1. Microfluïdische apparaat fabricage Een silicium meester mal van de microfluïdische lysis apparaat is gemaakt met behulp van standaard fotolithografische technieken met de apparatuur in de Universiteit van Louisville cleanroom [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc, San Rafael, CA) werd gebruikt om een ​​transparant masker te genereren (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) om de negatieve replica's van de kanalen te creëren. De microfluïdische lysis apparaat werd vervaardigd uit het…

Discussion

Een geautomatiseerde microfluïdische bloed lysis protocol is gemeld. Binnen het protocol zijn kritische stappen vermeldenswaard. In paragraaf P.2.1, is het belangrijk om verwijder de eerste bloed flacon verzameld als het monster verjaagd mature endotheelcellen als false positives. Zorg er ook voor om het bloedmonster draaien binnen een uur van de collectie. Het vullen van de microfluïdische apparaat in paragraaf P.2.2, is het belangrijk om in eerste instantie af van de belletjes. Bovendien moet men voorkomen dat er lu…

Materials