Технические примечания: Гелеобразование инициируется добавлением соли. Поэтому, очень важно, что ни соли вступают в контакт с PuraMatrix до гелеобразования желательно; воздействия соли очень низкой ионной силы (например, <0,05 М) приведет к необратимым гелеобразования. Оставшийся запас решений, которые готовы могут быть использованы позднее, если они не вступают в контакт с солями. Вам не нужно беспокоиться о том повторить ультразвуком. Пузырьки воздуха могут быть удалены aliquoting PuraMatrix в стерильные пробирки с последующим центрифугированием. Будьте очень осторожны при изменении СМИ как стремление может легко нарушить PuraMatrix постели. Материалы по теме: BD PuraMatrix RAD16 пептида Гидрогель-1% (Cat # 354250): общая концентрация пептида неразбавленной смеси составляет 10 мг / мл. Вода Sonicator Ванная или Vortex 96-луночного блюдо культуре клеток Медиа культуре клеток Стерильные Фильтрованный H 2 O Стерильные Фильтрованный 20% сахарозы Cells (всего на 5000 клеток / лунку): OVCAR-5 Все шаги должны быть выполнены в асептических условиях. Порядок действий: Разрушать ультразвуком 1% PuraMatrix (RAD16) в sonicator водяной бане в течение 30 минут, чтобы уменьшить вязкость перед использованием. 1% PuraMatrix решения теперь могут быть аликвоты в стерильные пробирки для упрощения будущих экспериментов. Избегайте образования пузырьков воздуха, а если они образуют просто спином вниз стерильные пробирки, содержащие PuraMatrix при 1000 оборотов в минуту (300 мкг) в течение 5 минут. Общей концентрации пептида неразбавленном смеси составляет 10 мг / мл. Два подхода по 4 скважины будут покрыты в дозе 2,5 мг / мл и 1,25 мг / мл общей концентрации пептида, соответственно. Развести PuraMatrix в каждой лунке комплекте с 0,2 мкм стерильно фильтруют 20% сахарозы и 13,3% сахарозы к общей пептидной концентрации 5 мг / мл и 2,5 мг / мл, соответственно, для достижения 2x концентрация BD PuraMatrix в 10% сахарозы. Сделать 20% сахарозы, развести 10 г сахарозы, то объем до 50 мл воды. 13% и 10% сахарозы может быть получен путем разбавления 20% маточного раствора. 13% сахарозы (на каждые 10 мл): 6,5 мл 20% сахарозы + 3,5 мл стерильного H 2 O. 10% сахарозы (на каждые 10 мл): 5,0 мл 20% сахарозы + 5,0 мл стерильного H 2 O. Подготовка мастер смесь пептидных PuraMatrix в зависимости от количества скважин вы собираетесь пластины. (См. пример ниже). Затем аликвоту в отдельные пробирки с 25 мл мастера микса. Мастер смесь должна быть готова в два раза желаемой конечной концентрации общего пептида, как это будет разбавляют равным объемом клеток в процессе металлизации. Подготовка клеточные суспензии по trypsinizing культурах клеток монослоя клеток. 2 мл 0,05% трипсина ЭДТА может быть использована для каждого Т-75 Flask. Нейтрализовать трипсина путем добавления культуры клеток, содержащих 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (использовать не менее 2 мл среды на мл трипсина использовали на предыдущем шаге.) Центрифуга клетки при 1000 оборотов в минуту (~ 300 мкг) в течение 5 минут, чтобы создать клеточный осадок. Ресуспендируют клеток в 10% стерильно фильтруют сахарозы. Граф клеток и со спином вниз снова при 1000 оборотов в минуту (~ 300 мкг) в течение 5 мин для удаления следовых количеств соли содержится в средствах массовой информации. Ресуспендируют OVCAR-5 клеток в 10% сахарозы, 2,0 х 10 5 клеток / мл, так что окончательное число клеток на лунку будет 5000 клеток в каждую лунку. Следующие шаги должны быть выполнены быстро. Добавьте 25 мкл 2,0 х 10 5 клеток / мл суспензии для первого индивидуального пробирку 25 мкл мастер смесь PuraMatrix, как показано на схеме. Быстро перемешать с помощью пипетки (~ 5 раз вверх и вниз) в трубке без введения пузырьков воздуха. Потом пипеткой 50 мкл суспензии клеток / PuraMatrix смесь в соответствующую лунку 96 и блюда. Инициировать гелеобразования PuraMatrix BD, осторожно пипетки 150 мкл культуры клеток (RPMI + 10% FBS) в сторону хорошо Повторите действия, описанные в 8, пока все скважины были покрыты. Через 30 минут очень осторожно удалить ~ 2 / 3 от носителя с помощью 200 мкл пипетки, чтобы уравновесить рН гидрогеля. НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ Вакуумный аспиратор, так как это нарушает MATRIX Место пипетки в хорошо так, чтобыон не касается PuraMatrix кровать и осторожно извлекайте носитель из колодца. Следует проявлять осторожность, чтобы не нарушить матрицы при культуре клеток в PuraMatrix. Очень осторожно добавить 150 мкл свежей среды культуры клеток в сторону так, содержащих клетки инкапсулированных в PuraMatrix. Изменение культуры клеток в каждой лунке каждые 48 часа со свежей культуральной среды, тщательно повторяя шаги 10 и 11. Представитель Результаты: Рисунок 1. OVCAR-5 инкапсулированные клетки, как описано в предыдущем протоколе. Изображения были получены с помощью перевернутого Olympus FV1000 микроскоп с Spectra-Physics DeepSee Ti: Sapphire лазера, настроенного на 750 нм. Изображений сессий были проведены в дни 1, 3, 5 и 7 после металлизации. Большое рабочее расстояние, вода погружения 40x цель (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) был использован для изображения через PuraMatrix. Трехмерная объемы были собраны за счет приобретения изображение стеки в 1,47 мкм осевого шага. Два не-descanned детекторов собраны аутофлюоресценция выбросов использованием фиолетового (440-490 нм) и зеленого (510-550 нм) полосового фильтра. Окончательного изображения и глубину стека фильмы были обработаны с использованием ImageJ путем сочетания обоих каналов обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.
