可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

Summary

の可視化<em> in vivoで</em> RNAのトランスポートは、蛍光標識RNA転写物のマイクロインジェクションによってに行われます<em>アフリカツメガエル</em>卵母細胞、共焦点顕微鏡に続く。

Abstract

RNAの局在は、細胞極性の確立に保存されたメカニズムです。 VG1 mRNAはアフリカツメガエルの卵母細胞と空間的にVG1蛋白質の遺伝子発現を制限する行為の植物極に局在化する。この方法でVG1分布の厳密な制御は、発生中の胚の適切な胚層の仕様が必要です。 mRNAの3'UTRのRNA配列の要素は、VG1ローカライズ要素（VLE）は必須と直接輸送するのに十分です。 in vivoで VG1 mRNAの認識と輸送を調べるため、我々は、単純な視覚的な読み出しを経由してトランスファクター向けトランスポートメカニズムの広範な分析を可能にするイメージング技術を開発した。

RNAの局在を可視化するために、我々は、蛍光標識VLEのRNAを合成し、個々の卵母細胞にその写しを顕微注入する。注入されたRNAの輸送を可能にするために卵母細胞の培養後、卵母細胞は、前の共焦点顕微鏡によるイメージングに固定し、脱水です。 mRNAの局在パターンの可視化は、RNAのトランスポートの完全な経路を監視し、シス作用転写内の要素とVLEに結合するトランス作用因子のためにRNAの輸送を指示するの役割を識別するための読み出しを提供する（ルイスら、2008、 Messittら、2008）。我々は、追加のRNAやタンパク質（ギャニオンとモウリー、2009年、Messittら、2008）との共局在を介し​​てこの手法を拡張しており、モーター蛋白質の崩壊と細胞骨格との組み合わせで（Messittら、2008）プローブにmRNAの局在のメカニズム。

Protocol

パート1：蛍光標識mRNAの転写。 RNAの局在化の要素や他の関連配列を含むプラスミドDNAを線形化し、DEPC処理H 2 Oでの1μg/μLで再懸濁します。 DNAテンプレートは、T7、SP6、またはT3 RNAポリメラーゼによる転写のための上流のプロモーター部位を持っている必要があります。 滅菌1.5mlチューブに下記の試薬を追加します。 A. 10X送信バッファ（M＆Mを参照） </td…

Discussion

ここでは、 アフリカツメガエルの卵母細胞におけるmRNAの局在を可視化するためのプロトコルを提示している。蛍光標識RNA転写物を使用して、このメソッドは、以前にジゴキシゲニン標識転写産物を得て、より簡単かつ迅速にその場ベースのアプローチよりもよりも、対ノイズ比の高い信号（モウリーとメルトン、1992、ガウトリューら、1997）があります。この方法を使用して、我々は…

Materials

10X Tx buffer

• 60 mM MgCl₂
• 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

• 10 mM CTP
• 10 mM ATP
• 9 mM UTP
• 2 mM GTP
• 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

• Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H₂O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions:
• 0.5 ml 0.2 M EDTA
• 1 ml 1 M Tris pH 8.0
• 0.5 ml 20% SDS
• Store complete G-50 solution at 4° C.
• Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny).
• Swirl complete G-50 solution to resuspend beads.
• Add 2 ml G-50 solution to the empty column.
• Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge.
• Add 200 μl DEPC-treated deionized H₂O to each column. Spin.
• Repeat wash twice more for a total of three washes.
• Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

• 75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 ml 0.1 M KPO₃+ (pH 7.4)

MBSH buffer

• 88 mM NaCl
• 1 mM KCl
• 2.4 mM NaHCO₃
• 0.82 mM MgSO₄ X 7H₂O
• 0.33 mM Ca(NO₃)₂ X 4H₂O
• 0.41 mM CaCl₂ X 6H₂O
• 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

• 50% L15 medium
• 15 mM HEPES (pH 7.6)
• 1 mg/ml insulin
• 100 mg/ml gentamicin
• 50 U/ml nystatin
• 50 U/ml penicillin
• 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

• 0.1 M MOPS (pH 7.4)
• 2 mM EGTA
• 1 mM MgSO₄
• 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

• Determine CPM in “input” and “incorporated” samples using a standard scintillation counter.
• incorporation = (“incorporated”) / (10 x “input”)
• Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10.
• Maximum theoretical yields for different polymerases:
  T7, T3, SP6 – 2.64 μg
• Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation)
• Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10^-8)
• The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.