Visualização de<em> In vivo</em> RNA de transporte é realizado por microinjeção de transcrições fluorescente etiquetado RNA em<em> Xenopus</em> Oócitos, seguido por microscopia confocal.
Localização de RNA é um mecanismo conservado do estabelecimento de polaridade celular. Vg1 mRNA localiza-se o pólo vegetal de oócitos Xenopus laevis e age para restringir espacialmente expressão gênica de Vg1 proteína. Um controlo apertado da Vg1 distribuição desta forma é necessário para especificação apropriada germe camada no embrião em desenvolvimento. Elementos de seqüência RNA na 3 'UTR do mRNA, o elemento de localização Vg1 (VLE) são necessários e suficientes para transporte directo. Para estudar o reconhecimento e transporte de Vg1 mRNA in vivo, temos desenvolvido uma técnica de imagem que permite a análise extensiva de trans-fator de mecanismos de transporte através de uma leitura dirigida visual simples.
Para visualizar a localização RNA, podemos sintetizar RNA fluorescente etiquetado VLE e microinject esta transcrição em oócitos individual. Após o cultivo de oócitos para permitir o transporte do RNA injetado, ovócitos são fixos e desidratado antes de imagens por microscopia confocal. Visualização dos padrões de localização mRNA fornece uma leitura para o monitoramento da via completa de RNA de transporte e para a identificação de papéis na direção de RNA de transporte para cis-acting elementos dentro da transcrição e trans-acting fatores que se ligam ao VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Nós estendemos esta técnica através de co-localização com RNAs adicionais e proteínas (Gagnon e Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), e em combinação com a perturbação de proteínas motoras eo citoesqueleto (Messitt et al., 2008) para investigar mecanismos subjacentes localização mRNA.
Aqui nós apresentamos um protocolo para a visualização de localização mRNA em oócitos Xenopus. Este método, usando transcrições fluorescente etiquetado RNA tem maior relação sinal-ruído do que o anteriormente obtido com marcada com digoxigenina transcrições e é mais simples e mais rápido do que in-situ abordagens baseadas (Mowry e Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Usando este método, podemos engenheiro RNA mutações sequência e rapidamente teste para função in vivo. Al…
The authors have nothing to disclose.
Nosso trabalho na localização RNA é suportado por uma concessão do NIH (R01GM071049) a KLM.
10X Tx buffer
20x cap/NTP mix
G-50 column
Collagenase solution
MBSH buffer
Oocyte Culture Medium
MEMFA solution
Computing RNA yield