세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상
Summary
이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.
Abstract
zebrafish는 생체내 개발 중에 이미징 세포 행동에 대한 이상적인 모델입니다. Zebrafish의 배아는 외부 수정된 개발의 모든 단계에 따라서 쉽게 액세스할 수 있습니다. 또한, 그들의 광학 선명도는 그대로 배아의 자연 환경에서 세포와 분자 역학의 고해상도 이미징 수 있습니다. 우리는 신경 능선 세포의 연결을 마이 그 레이션 및 axons의 파생물 및지도하는 동안 세포 행동을 분석하는 라이브 이미징 방법을 사용하고 있습니다.
라이브 영상은 세포 운동성 프로세스를 조절 메커니즘을 이해하는 데 특히 유용합니다. 등 밀어내는 활동 및 분자 역학과 같은 세포 운동성 대한 자세한 내용을 시각화하기 위해서는 각각의 세포를 레이블에 유리합니다. zebrafish에서 플라스미드 DNA의 주입은 일시적 모자이크 표현 패턴을 산출 및 기타 셀 라벨 방법을 통해 독특한 혜택을 제공합니다. 예를 들어, 유전자 변형 라인은 종종 전체 세포 인구를 분류하고 있으므로 하나의 세포에서 미세 라고나할까요 (또는 분자 분포의 변화)의 시각화을 정확히 파악하기 어렵습니다. 또한, 한 세포 단계에서 DNA의 주입은 적게 침략 이후 단계에서 염료를 주사보다 더 정확합니다.
여기는 개별 개발 뉴런 또는 신경 크레스트 세포 및 이미징 생체내 그들의 행동을 라벨에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 모자이크 transgene 발현 결과 1 – 세포 단계의 배아로 플라스미드 DNA를 주입. 벡터는 세포 특정 발기인을 포함 감각 뉴런 또는 신경 크레스트 세포의 일부에 대한 관심의 유전자의 드라이브 표현. 우리는 막 대상 GFP 또는 셀에 1을 생활에서 F – 굴지의 시각화을 허용하는 바이오 센서 프로브와 함께 레이블 세포의 예제를 제공합니다.
에리카 앤더슨, Namrata Asuri, 그리고 매튜 클레이이 작품에 동등하게 공헌했습니다.
Protocol
Discussion
주입된 DNA의 최적 농도는 구조 경험적으로 결정되어야하는 모터의 크기와 강도에 따라 달라집니다. 너무 작은 transgene 표현을 주입 배아의 아주 극소수의 결과되지만 너무 DNA의 사출은 광범위한 세포 죽음으로 건강하지 못한 배아 발생할 수 있습니다. DNA 표현 수준은 세포에서 세포로 다릅니다 형광단 신호의 강도와 연결합니다. epifluorescence 아래의 배아를 정렬하지만, 표현의 매우 높은 수준들을…
Acknowledgements
이 작품은 MCH 올림푸스 FV1000 공촛점에 NS042228이 UW 동물학과 (PI 빌 베먼트)에 NIH 공유 장비 부여 S10RR023717로 인수되었다 NIH R01에 의해 지원되었다.
에리카 앤더슨, Namrata Asuri, 그리고 매튜 클레이는이 종이에 똑같이 기여.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
| Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |
References
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