Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo's
Summary
Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.
Abstract
De zebravis is een ideaal model voor beeldvorming cel gedrag tijdens de ontwikkeling in vivo. Zebravis embryo's worden extern bevrucht en dus gemakkelijk te bereiken in alle stadia van ontwikkeling. Bovendien, hun optische helderheid maakt hoge resolutie imaging van cel-en moleculaire dynamica in de natuurlijke omgeving van de intacte embryo. We maken gebruik van een live-imaging benadering naar cel gedrag te analyseren tijdens de neurale lijst cel migratie en de uitgroei en begeleiding van neuronale axonen.
Live-imaging is vooral nuttig voor het begrijpen van mechanismen die celmotiliteit processen te reguleren. Te visualiseren details van celbeweeglijkheid, zoals stuwend activiteit en moleculaire dynamica, is het voordelig om individuele cellen label. In de zebravis, plasmide DNA injectie levert een voorbijgaande mozaïek expressiepatroon en biedt duidelijke voordelen ten opzichte van andere cel etikettering methoden. Bijvoorbeeld, transgene lijnen vaak label hele cel populaties en kan dus visualisatie van de boete uitsteeksels (of veranderingen in de moleculaire distributie) in een enkele cel onduidelijk. Daarnaast, injectie van DNA in de een-cellig stadium is minder invasief en preciezer dan kleurstof injecties in latere stadia.
Hier beschrijven we een methode voor het labelen van de individuele ontwikkeling van neuronen of neurale cellen en imaging hun gedrag in vivo. We injecteren plasmide DNA in een-cellig stadium embryo's, wat resulteert in mozaïek transgenexpressie. De vectoren bevatten cel-specifieke promotors die rijden expressie van een gen van interesse in een subset van de sensorische neuronen of neurale lijst cellen. Wij bieden voorbeelden van cellen gelabeld met membraan gerichte GFP of met een biosensor sonde die visualisatie van F-actine laat in levende cellen 1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, en Matthew Clay droegen ook voor dit werk.
Protocol
Discussion
De optimale concentratie van geïnjecteerde DNA zal variëren afhankelijk van de grootte en de sterkte van de promotor en de bouw moet empirisch vastgesteld worden. Injectie van te veel DNA kan leiden tot ongezonde embryo's met uitgebreide celdood, terwijl er te weinig zal resulteren in een zeer klein deel van de geïnjecteerde embryo's de uiting van de transgen. De DNA-expressie correleert met de sterkte van het fluorofoor-signaal, dat varieert van cel naar cel. Terwijl het sorteren van embryo's onder epifl…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH R01 NS042228 naar MCH De Olympus FV1000 confocale werd verworven met een gezamenlijke NIH instrumentatie te verlenen S10RR023717 aan de UW Zoölogie Department (PI Bill Bement).
Erica Andersen, Namrata Asuri, en Matthew Clay droegen ook aan deze krant.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
| Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |
References
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
