Живая съемка подвижность клеток и актинового цитоскелета отдельных нейронов и нервных клеток Крест в данио рерио Эмбрионы
Summary
Этот протокол описывает изображения отдельных нейронов или нервных клеток гребня в живых рыбок данио эмбрионов. Этот метод используется для изучения поведения и сотовой локализации актина с помощью флуоресцентной конфокальной покадровой микроскопии.
Abstract
Данио является идеальной моделью для работы с изображениями камера поведения в процессе развития в естественных условиях. Данио рерио эмбрионы внешне оплодотворенной и, следовательно, легко доступны на всех этапах развития. Более того, их оптическая прозрачность позволяет высоким разрешением клеточной и молекулярной динамики природной среды нетронутыми эмбриона. Мы используем подход жить изображений для анализа поведения ячейки во время нейронные миграции клеток гребня и результатом и руководства нейронных аксонов.
Живая изображения особенно полезна для понимания механизмов, регулирующих процессы клеточной подвижности. Чтобы представить себе детали клеточной подвижности, таких как выступающими деятельности и молекулярная динамика, это выгодно для обозначения отдельных ячеек. В данио рерио, ДНК плазмиды инъекция дает переходный характер экспрессии мозаики и предлагает явные преимущества перед другими методами маркировки клеток. Например, трансгенные линии часто этикетке всей популяции клеток и таким образом может заслонить визуализации тонких выступов (или изменений в молекулярно-массовое распределение) в одну ячейку. Кроме того, введение ДНК в один-клеточной стадии менее инвазивных и более точных, чем краситель инъекции на более поздних этапах.
Здесь мы опишем метод маркировки отдельных развивающихся нейронов или нервных клеток гребня и визуализации их поведение в естественных условиях. Мы вводят плазмиды ДНК в 1-клеточной стадии эмбриона, в результате чего мозаика выражение трансгена. Векторы содержат ячейки конкретных промоутеров, которые управляют выражение гена в подмножество сенсорных нейронов или нервных клеток гребня. Мы предоставляем примеры клетки помечены мембраны целевых GFP или биосенсор зонд, который позволяет визуализировать F-актина в живых клетках 1.
Эрика Андерсена, Namrata Asuri, и Мэтью Клей способствовали в равной степени к этой работе.
Protocol
Discussion
Оптимальная концентрация вводили ДНК будет варьироваться в зависимости от размера и силы промоутер строительства и должен быть определен эмпирически. Инъекция слишком много ДНК может привести к нездоровым эмбрионов с обширной гибель клеток, в то время слишком мало приведет к очень н?…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH R01 NS042228 к MCH Olympus FV1000 конфокальной была приобретена с приборами NIH общие грант S10RR023717 к UW кафедре зоологии (П. И. Билл Бемент).
Эрика Андерсена, Namrata Asuri, и Мэтью Клей способствовали в равной степени к этой статье.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
| Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |
References
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
