व्यक्तिगत Zebrafish भ्रूण में न्यूरॉन्स और तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के सेल गतिशीलता और actin cytoskeleton के लाइव इमेजिंग
Summary
इस प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण में रहने वाले व्यक्ति या न्यूरॉन्स के तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की इमेजिंग का वर्णन करता है. इस विधि के सेलुलर व्यवहार और actin स्थानीयकरण प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी समय चूक का उपयोग की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Abstract
zebrafish इमेजिंग vivo में विकास के दौरान सेल के व्यवहार के लिए एक आदर्श मॉडल है. Zebrafish भ्रूण बाह्य निषेचित कर रहे हैं और इस तरह आसानी से विकास के सभी चरणों में सुलभ है. इसके अलावा, उनके ऑप्टिकल स्पष्टता बरकरार भ्रूण के प्राकृतिक वातावरण में सेल और आणविक गतिशीलता के उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति देता है. हम एक जीवित इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे हैं तंत्रिका शिखा सेल प्रवास और परिणाम और neuronal axons की मार्गदर्शन के दौरान सेल व्यवहार का विश्लेषण.
लाइव इमेजिंग तंत्र है कि सेल गतिशीलता की प्रक्रिया को विनियमित समझने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. आगे फैलनेवाला गतिविधि और सेल गतिशीलता के आणविक गतिशीलता के विवरण जैसे, कल्पना, यह व्यक्ति की कोशिकाओं लेबल के लिए फायदेमंद है. Zebrafish में, डीएनए प्लाज्मिड इंजेक्शन पैदावार एक क्षणिक मोज़ेक अभिव्यक्ति पैटर्न और अन्य सेल लेबलिंग तरीकों पर अलग लाभ प्रदान करता है है. उदाहरण के लिए, ट्रांसजेनिक लाइनों अक्सर पूरे सेल आबादी लेबल और इस प्रकार किसी एकल कक्ष (या वितरण में आणविक परिवर्तन) में ठीक protrusions के दृश्य अस्पष्ट हो सकता है. इसके अलावा, डीएनए के एक सेल मंच पर इंजेक्शन कम आक्रामक और बाद में चरणों में डाई इंजेक्शन की तुलना में अधिक सटीक है.
यहाँ हम व्यक्ति के विकास न्यूरॉन्स या तंत्रिका शिखा कोशिकाओं और इमेजिंग vivo में उनके व्यवहार लेबल के लिए एक विधि का वर्णन. हम एक सेल चरण भ्रूण, मोज़ेक transgene अभिव्यक्ति में जो परिणाम में प्लास्मिड डीएनए इंजेक्षन. वैक्टर सेल विशिष्ट प्रमोटरों होते हैं कि संवेदी न्यूरॉन्स या तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की एक सबसेट में ब्याज की एक जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव. हम झिल्ली लक्षित GFP के साथ या कि 1 कोशिकाओं में रहने वाले एफ actin के दृश्य की अनुमति देता है एक biosensor जांच के साथ लेबल की कोशिकाओं के उदाहरण देते हैं.
एरिका एंडरसन, नम्रता Asuri, और मैथ्यू क्ले इस काम के लिए समान रूप से योगदान दिया.
Protocol
Discussion
इंजेक्शन डीएनए के इष्टतम एकाग्रता आकार और प्रमोटर की ताकत के आधार पर निर्माण और empirically निर्धारित किया जाना चाहिए अलग अलग होंगे. बहुत ज्यादा डीएनए इंजेक्शन व्यापक कोशिका मृत्यु के साथ अस्वास्थ्यकर भ्रू…
Acknowledgements
यह काम R01 NIH द्वारा समर्थित किया गया NS042228 मातृ एवं शिशु स्वास्थ्य ओलिंप FV1000 confocal एक NIH साझा UW जूलॉजी विभाग (पीआई विधेयक Bement) इंस्ट्रूमेंटेशन S10RR023717 अनुदान के साथ अधिग्रहण कर लिया था.
एरिका एंडरसन, नम्रता Asuri, और मैथ्यू क्ले इस पत्र के लिए समान रूप से योगदान दिया.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
| Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |
References
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
