Um protocolo detalhado é descrito para a formação de imagem em tempo real de complexos de reparo de DNA em<em> Bacillus subtilis</em> Células.
Ambos os procariotas e eucariotas responder a danos no DNA através de um complexo conjunto de alterações fisiológicas. Alterações na expressão gênica, a redistribuição de proteínas existentes, ea montagem de complexos de proteínas novo pode ser estimulada por uma variedade de lesões de DNA e de pares de bases incompatíveis DNA. Microscopia de fluorescência tem sido utilizada como uma poderosa ferramenta experimental para visualizar e quantificar as respostas para essas e outras lesões de DNA e para monitorar o status de replicação de DNA dentro da complexa arquitetura subcelular de uma célula viva. Fusões de translação entre proteínas fluorescentes e componentes repórter da replicação do DNA e máquinas de reparação têm sido usados para determinar as sugestões que visam as proteínas do reparo do DNA de suas lesões cognate<em> In vivo</em> E para entender como essas proteínas são organizados dentro das células bacterianas. Além disso, fusões de transcrição e translação ligadas a promotores de DNA induzida danos revelaram que as células dentro de uma população de ter activado as respostas ao estresse genotóxico. Nesta revisão, nós fornecemos um protocolo detalhado para o uso de microscopia de fluorescência para a imagem da montagem de reparo de DNA e complexos de DNA de replicação em single células bacterianas. Em particular, este trabalho se concentra em proteínas incompatibilidade imagem reparo, recombinação homóloga, a replicação de DNA e uma proteína induzível SOS-in<em> Bacillus subtilis</em>. Todos os procedimentos aqui descritos são facilmente passíveis de complexos de proteínas de imagens em uma variedade de espécies bacterianas.
Tentativa e erro são necessários para encontrar as condições de exposição de imagens da mais alta qualidade para cada cepa, e supomos que 1 milissegundo é apropriado para imagens com luz branca, enquanto exposições de 100 a 2000 ms são apropriados para GFP (FITC) e FM4-64 (TRITC ) imagens. Tempo de exposição vai variar dependendo do equipamento de imagem utilizada. Recomendamos o uso de uma cepa por 15 bem-lâmina de microscópio para a imagem mais simples, como a qualidade pad e difusão de células da fron…
Os autores gostariam de agradecer as Dras. Philina S. Lee e Alan D. Grossman para a formação inicialmente LAS em microscopia de fluorescência. Os autores também agradecer as Dras. Melanie Berkmen e Hajime Kobayashi para a ajuda e dicas para a imagem latente. Este trabalho foi financiado por fundos start-up da Faculdade de Literatura, Ciência e Artes e do Departamento de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento na Universidade de Michigan.
Specific solution recipes1:
10x S750 salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage
100x Metals
0.2 M MgCl2
70 mM CaCl2
5 mM MnCl2
0.1 mM ZnCl2
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl3*
dH2O to final volume
*FeCl3 should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.
S750 media
1x S750 salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H2O to final volume
10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO4 (2g/L)
dH2O to final volume
Filter sterilize