Une méthode améliorée d'isolement d'ARN à partir de pin taeda ( P. taeda L.) et d'autres conifères
Summary
Beaucoup de tissus végétaux, y compris le phloème et le xylème de pin à encens (<em> Pinus taeda</em> L.), contiennent des niveaux élevés de composés phénoliques et des polysaccharides qui interfèrent avec la purification d'ARN. Cette présentation aborde les techniques pour la récolte du champ cultivé des tissus et l'isolement de l'ARN d'une qualité suffisante pour les microarrays et les analyses génomiques d'autres.
Abstract
Tissus isolés à partir d'espèces de conifères, en particulier celles appartenant à la famille des Pinacées, comme le pin taeda (<em> Pinus taeda</em> L.), contiennent des concentrations élevées de composés phénoliques et des polysaccharides qui interfèrent avec la purification d'ARN. Isolation de haute qualité de l'ARN à partir de ces espèces nécessite des procédures rigoureuses de collecte de tissus dans le domaine et l'emploi d'un protocole d'isolement d'ARN composée de plusieurs étapes d'extraction organique afin d'isoler l'ARN de qualité suffisante pour biopuces et d'autres analyses génomiques. L'isolement de la haute qualité d'ARN à partir d'échantillons prélevés sur le terrain pin blanc peut être difficile, mais plusieurs modifications des tissus et des procédures standard d'isolement d'ARN grandement améliorer les résultats. L'étendue de la dégradation de l'ARN en général augmente si les échantillons ne sont pas correctement collectés et transportés sur le terrain, notamment lors des récoltes de grande envergure. Total des rendements d'ARN peut être augmenté de manière significative par des échantillons de pulvérisation dans un moulin congélateur à azote liquide avant d'isolement de l'ARN, en particulier lorsque les échantillons proviennent de tissus ligneux. Cela est principalement dû à la présence d'agents oxydants, tels que les composés phénoliques et des polysaccharides qui sont tous deux présents à des niveaux élevés dans les extraits des tissus ligneux des espèces les plus conifères. S'il n'est pas retiré, ces contaminants peuvent mener au cours conduisant à des problèmes tels que la dégradation de l'ARN, qui se traduisent par de faibles rendements et une mauvaise qualité de l'échantillon d'ARN. Report des composés phénoliques, ainsi que des polysaccharides, peuvent également réduire ou même éliminer complètement l'activité de la transcriptase inverse ou les autres polymérases couramment utilisé pour la synthèse de l'ADNc. En particulier, l'ARN destiné à être utilisé comme modèle pour double-brin de synthèse d'ADNc dans la génération de banques d'ADNc simple brin synthèse de l'ADNc pour la PCR ou PCR quantitative, ou pour la synthèse de matériaux cibles biopuces doivent être de la meilleure qualité si les chercheurs s'attendent à d'obtenir des résultats optimaux. Techniques d'isolement d'ARN couramment employée pour de nombreuses autres espèces végétales sont souvent insuffisants dans leur capacité à éliminer ces contaminants à partir d'échantillons de conifères et n'ont donc pas le rendement total d'échantillons d'ARN adapté à des manipulations en aval. Dans cette vidéo, nous démontrent les méthodes de collecte domaine des tissus de conifères, en commençant par l'abattage d'une quarantaine d'année vieil arbre, à la récolte de phloème, xylème secondaire, et le xylème bois de réaction. Nous démontrons également un protocole d'isolement d'ARN qui a constamment donné de haute qualité pour les ARN ultérieures manipulations enzymatique.
Protocol
Discussion
Obtention de haute qualité d'ARN à partir des espèces de conifères peut être une tâche difficile étant donné les niveaux élevés de composés phénoliques et des polysaccharides présents dans les tissus ligneux. En commençant par le protocole développé par Chang et al. (1), nous avons constaté que l'extraction de plus de rigueur et de nettoyer marches mènent à l'isolement cohérente de très haute qualité d'ARN total de Woody diverses et non ligneuses des tissus prélevés sur une grande…
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les personnes suivantes sans l'aide desquels la collecte de tissus de pin n'aurait pas été possible: le Dr Joe Nairn, Matt Bryman, Michael Bordeaux, Ujwal Bagal, Huizhe Jin, et Amanda Bouffier.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
