로블롤리 파인로부터 RNA 분리의 개선 방법 ( P. taeda L.) 및 기타 코니퍼 종
Summary
체관부 및 로블롤리 파인에서 목부 등 많은 식물 조직 (<em> 피너스 taeda</em> L.), phenolics 및 RNA 정화 방해 다당류의 높은 수준을 포함합니다. 이 프레 젠 테이션 현장 성장 조직 및 microarrays 및 기타 게놈 분석을위한 충분한 품질의 RNA의 분리의 수확 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
조직은 로블롤리 파인로 특히 침엽수 종, Pinaceae 가족에 속한 사람 (격리<em> 피너스 taeda</em> L.), RNA 정화 방해 페놀 수지 carbon 화합물 및 다당류의 높은 농도를 포함하고 있습니다. 이러한 종류의 고품질의 RNA의 분리는 microarray 및 기타 게놈 분석을위한 충분한 품질의 RNA를 분리하기 위해 여러 유기 추출 단계로 구성된 RNA 격리 프로토콜 분야와 고용 엄격한 조직 수집 절차가 필요합니다. 현장 수집 로블롤리 파인 샘플 도전 수 있지만, 표준 조직 및 RNA 분리 절차를 몇 가지 수정을 크게 결과를 개선에서 고품질의 RNA의 분리. 샘플이 제대로 특히 대규모 수확 중에 수집 및 현장에서 이송되지 않은 경우 일반적으로 RNA 저하의 정도는 증가합니다. 총 RNA의 수율은 시료가 우디 조직에서 온 특히, 절연을 RNA하기 전에 액체 질소 냉동고 공장에서 pulverizing 샘플로 크게 증가 수 있습니다. 이것은 주로 이러한 페놀 수지 carbon 화합물, 그리고 모두 대부분의 침엽수 종의 우디 조직의 추출물에서 높은 수준에 존재하는 다당류로서 산화 대리인의 존재로 인해 발생합니다. 제거하지 않으면 이러한 오염 물질은 RNA 저하, 낮은 수율에 결과 및 품질 RNA 샘플로 문제에 이르는 이월 수 있습니다. 페놀 수지 carbon 화합물뿐만 아니라 다당류의 Carryover도 감소 또는 완전히 일반적으로 cDNA 합성에 사용되는 역방향 transcriptase 또는 기타 polymerases의 활동을 제거할 수 있습니다. 연구자들은 기대하고있다면 특히, RNA는 cDNA 라이브러리의 생성을 두 번 좌초 cDNA 합성, PCR 또는 qPCR의에 대한 단일 좌초 cDNA 합성하거나, microarray 대상 물질의 합성에 대한 템플릿으로 사용되는 운명 것은 최고의 품질이어야합니다 최적의 결과를 얻을 수 있습니다. 일반적으로 많은 다른 식물 종족에 대한 고용 RNA 격리 기술 코니퍼 샘플에서 이러한 오염 물질을 제거하고 따라서 스트림 조작에 적합한 총 RNA 샘플을 포기하지 자신의 능력에 종종 부족한 있습니다. 이 비디오에서는 체관부의 수확, 보조 목부와 반응 나무 목부로 사십년 – 오래된 나무의 벌목으로 시작, 코니퍼 조직의 현장 수집 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 지속적으로 후속 효소 조작을위한 고품질의 RNA가 생긴 RNA 격리 프로토콜을 보여줍니다.
Protocol
Discussion
침엽수 종에서 고품질의 RNA를 구하기 우디 조직에서 발견 페놀 수지 carbon와 다당류 화합물의 높은 수준을 주어 어려운 작업이 될 수 있습니다. 장 외 개발한 프로토콜로 시작. (1), 우리는 더 엄격한 추출을 발견하고 침엽수 종의 다양한에서 샘플 다양한 우디 및 비 – 우디 조직에서 매우 높은 품질의 총 RNA의 일관된 고립으로 이어질 단계를 정리했습니다. 이 비디오는 우리 수정된 RNA 격리 프로토?…
Acknowledgements
닥터 조 나이른, 매트 Bryman, 마이클 보르도, Ujwal Bagal, Huizhe 진, 아만다 Bouffier : 우리는 누구의 도움이 소나무 조직의 수집이 가능 않았을 텐데하지 않고 다음 사람에게 감사를 표합니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
