Um método melhorado de isolamento de RNA Pine Loblolly ( P. taeda L.) e espécies de coníferas Outros
Summary
Muitos tecidos vegetais, incluindo floema e xilema do pinheiro (<em> Pinus taeda</em> L.), contêm altos níveis de compostos fenólicos e polissacarídeos que interferem com a purificação de RNA. Esta apresentação discute técnicas para a colheita de tecidos cultivados em campo e isolamento de RNA de qualidade suficiente para microarrays e outras análises genômicas.
Abstract
Tecidos isolados de espécies de coníferas, particularmente aqueles que pertencem à família Pinaceae, como o pinus taeda (<em> Pinus taeda</em> L.), contêm altas concentrações de compostos fenólicos e polissacarídeos que interferem com a purificação de RNA. Isolamento de RNA de alta qualidade destas espécies requer procedimentos rigorosos de recolha de tecidos no campo eo emprego de um protocolo de isolamento de RNA composto de várias etapas de extração orgânica, a fim de isolar o RNA de qualidade suficiente para microarray e outras análises genômicas. O isolamento de RNA de alta qualidade a partir do campo de coleta de amostras de pinheiro pode ser um desafio, mas várias modificações para o tecido padrão e procedimentos de isolamento do RNA melhorar significativamente os resultados. A extensão da degradação geral RNA aumenta se as amostras não são devidamente recolhidos e transportados do campo, especialmente durante grande escala colheitas. Rendimentos totais RNA pode ser aumentada significativamente por amostras de pulverização em uma fábrica de nitrogênio líquido freezer antes de RNA de isolamento, especialmente quando as amostras provenientes de tecidos lenhosos. Isto é principalmente devido à presença de agentes oxidantes, tais como compostos fenólicos e polissacarídeos que estão presentes em níveis elevados em extratos de tecidos de espécies lenhosas mais coníferas. Se não forem removidos, esses contaminantes podem transitar levando a problemas como a degradação de RNA, que resultam em baixo rendimento e uma má qualidade da amostra de RNA. Transição de compostos fenólicos, bem como polissacarídeos, também pode reduzir ou mesmo eliminar completamente a atividade de transcriptase reversa ou polimerase outros comumente utilizados para a síntese de cDNA. Em particular, RNA destinado a ser usado como modelo para double-stranded síntese de cDNA na geração de bibliotecas de cDNA, single-stranded síntese de cDNA por PCR ou qPCR, ou para a síntese de materiais alvo microarray deve ser da mais alta qualidade se os pesquisadores esperam para obter melhores resultados. Técnicas de isolamento de RNA comumente empregados para muitas outras espécies de plantas são muitas vezes insuficientes na sua capacidade de remover estes contaminantes a partir de amostras de coníferas e, portanto, não produzem RNA total de amostras adequadas para manipulações a jusante. Neste vídeo podemos demonstrar os métodos para a coleta de campo de tecidos de coníferas, começando com a derrubada de uma árvore anos quarenta, para a colheita de floema, xilema secundário e xilema de madeira de reação. Nós também demonstramos um protocolo de isolamento de RNA que tem consistentemente rendeu RNA de alta qualidade para posterior manipulação enzimática.
Protocol
Discussion
Obtenção de RNA de alta qualidade a partir de espécies de coníferas pode ser uma tarefa difícil, dado os altos níveis de compostos fenólicos e polissacarídeos encontrados em tecidos lenhosos. Começando com o protocolo desenvolvido por Chang et al. (1), descobrimos que a extração de mais rigoroso e limpar passos conduzem ao isolamento consistente de muito alta qualidade RNA total do woody woody vários e não-tecidos amostrados de uma grande variedade de espécies de coníferas. Este vídeo tem demonstrado nã…
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer as seguintes pessoas, sem cuja ajuda a coleção de tecidos de pinho não teria sido possível: Dr. Joe Nairn, Matt Bryman, Michael Bordeaux, Ujwal Bagal, Huizhe Jin, e Amanda Bouffier.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
