ロボロリーパインからのRNA分離の改良法（ P. taeda L.）及びその他の針葉樹種
Summary
テーダマツから篩部および木部を含む多くの植物組織、（<em>テーダマツ</em> L.）、フェノール類およびRNA精製を妨害する多糖類の高レベルが含まれています。このプレゼンテーションでは、屋外栽培の組織やマイクロアレイや他のゲノム解析のための十分な品質のRNAの単離の収穫のためのテクニックを説明します。
Abstract
このようなテーダマツ（のような特に針葉樹の種、マツ科のファミリーに属するものから分離された組織、<em>テーダマツ</em> L.）、RNAの精製を妨害するフェノール化合物と多糖類の高濃度が含まれています。これらの種から高品質のRNAの単離は、マイクロアレイや他のゲノム解析のために十分な品質のRNAを分離するために、複数の有機溶媒抽出のステップから構成されるRNAの分離のプロトコルのフィールドと雇用の厳格な組織の収集手順が必要です。フィールドで収集テーダマツのサンプルから高品質のRNAの分離は非常に結果を改善に挑戦、しかしいくつかの標準的な組織の変更やRNAの分離の手続きができます。サンプルが正常に特に大規模な収穫時に、フィールドから収集し、輸送されていない場合、一般的なRNA分解の程度が増加する。トータルRNAの収量はサンプルがwoodyの組織から来た場合は特に、分離をRNAに前に液体窒素の冷凍工場でサンプルを粉砕して大幅に増加することができます。これは主にこのようなフェノール化合物、および両方のほとんどの針葉樹種の木質組織からの抽出物中の高濃度で存在する多糖類などの酸化剤の存在、によるものです。削除しない場合、これらの汚染物質は、そのようなRNAの分解、低収量と低品質RNAサンプルでその結果としての問題、につながる以上運ぶことができる。フェノール化合物だけでなく、多糖類のキャリーオーバーは、また減らすか、完全に逆転写酵素または一般的なcDNA合成に使用される他のポリメラーゼの活性をなくすことができます。研究者が期待するなら、特に、cDNAライブラリーの世代の二本鎖cDNA合成のテンプレートとして使用される運命RNA、PCRや定量PCRのために、またはマイクロアレイターゲット材料の合成のための一本鎖cDNA合成は、最高品質のものでなければならない最適な結果を得るために。一般的に他の多くの植物種に用いるRNAの分離技術は、針葉樹のサンプルからこれらの汚染物質を除去するため、下流の操作に適したトータルRNAサンプルを得られない能力がしばしば不十分である。このビデオでは、篩部の収穫、二次木部、およびあて材の木部に、40年前の木の伐採をはじめ、針葉樹の組織のフィールドのコレクションのための方法を示しています。我々はまた、一貫して、その後の酵素的操作のための高品質のRNAをもたらしましたRNAの分離のプロトコルを示しています。
Protocol
Discussion
針葉樹の種から高品質のRNAを得ることは木質の組織で検出されたフェノール及び多糖類化合物を高レベルで与えられる困難な作業になる場合があります。 Changらによって開発されたプロトコルを使用して起動。 （1）、我々はより厳密な抽出を発見し、様々な木質と針葉樹種の多種多様なサンプリング非木質組織から非常に高品質のトータルRNAの一貫性のある分離する可能性の手順をクリー?…
Acknowledgements
博士ジョーネアン、マットBryman、マイケルボルドー、Ujwal Bagal、Huizheジン、そしてアマンダBouffier：我々は、そのヘルプマツ組織の収集は不可能だったでしょうせずに次の人に感謝の意を表します。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | |||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | ||
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | ||
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | |||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | |||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | |||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | |||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-16B | ||
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo-Fisher | #05-562-10K | ||
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR | #21008-939 | ||
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo-Fisher | #2302830 | ||
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion, Inc. | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
