Опробование Способность к диффузии сигнальных молекул переориентировать Эмбриональные спинного спаечный Аксоны
Summary
Этот тест оценивает способность сигнальной молекулы, здесь костные морфогенетические белки 7 (BMP7), переориентировать спаечный аксонов. Эксплантов эмбриональной спинной спинного мозга выращиваются прилегающих к совокупности COS клетки, секретирующие факторы роста кандидата. Переориентация спаечный аксонов, растущее внутри эксплантатов визуализируются по иммуногистохимии.
Abstract
Спинной спаечный аксонов в спинном мозге позвоночных 1 были неоценимую системы модель, в которой для выявления сигналов аксонов руководства. Здесь мы описываем в пробирке анализ ", переориентация анализа", который широко используется для изучения влияния внешних и внутренних сигналов от ориентации спаечный аксонов 2. Этот анализ был разработан многочисленный народ в лабораториях Джейн Додд, Томас Jessell и Эндрю Ламсден (см. благодарность за более подробной информацией) и версии данного анализа были использованы для демонстрации переориентации деятельности ключевых молекул, руководство аксонов, в том числе БМП chemorepellent в потолочной панелью 3,4 и chemoattractive деятельности Netrin1 5 и Еж Соник (SHH) 6 в пол пластины в спинном мозге.
Эксплантов включающий 2-3 сегментов спинного две трети спинного мозга расчлененное из эмбриональных день (E) 11 крыс и культивировали в трехмерном гели коллагена 7. E11 спинной спинного эксплантов содержать новорожденного спаечный нейронов, которые могут быть идентифицированы по их аксонального выражение гликопротеин, Tag1 8. В течение 30-40 часов в культуре, спаечный траектории аксона воспроизводятся в этих спинной эксплантов со временем конечно же, увидеть в естественных условиях. Это аксонального траектория может быть обжаловано путем размещения либо тест ткани или совокупности COS ячейки выражения кандидата сигнальной молекулы в контакте с одной из боковых краев спинной эксплантов. Спаечный аксонов расширения в непосредственной близости от добавляется ткань будет расти под влиянием как эндогенных пластины крыши и сигналы от внематочной боковой ткани. Степень, в которой спаечный аксоны переориентированы в этих условиях могут быть определены количественно. С помощью этого теста, можно и рассмотреть достаточность определенный сигнал для переориентации спаечный аксонов 3,4, а также необходимость для этого сигнала, чтобы направить спаечный траектории 9.
Protocol
Discussion
Критические факторы, которые определяют успех в выполнении этого теста во-первых, ткань не следует относиться с dispase слишком длительного периода, такое лечение может привести к ткань становится очень липким и снизившись жизнеспособность. Два, коллагена должны быть идеально загрунтова…
Acknowledgements
Этот протокол был разработан в лабораториях Джейн Додд, Томас Jessell и Эндрю Ламсден. Многие люди, в том числе Конрад Basler, Энн Calof, Томас Эдлунд, Фил Гамильтон, Домна Karagogeos, Ариэль Руис я Altaba и Toshiya Ямада определяется как культура эксплантов спинного мозга в коллагене. Марыся Плачека и Марк Тессье-Лавинь впервые методика использования аксон рост в пробирке из эксплантов в качестве средства идентификации молекул аксон руководства. Работа в Батлер лаборатории поддержана грантами марте Dimes и R01 NS063999 из NIH / NINDS.
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
