Optimerad Fibrin Gel Bead-analys för studier av angiogenes

Summary

Denna video visar protokollet från ett in vitro-angiogenes analysmetod som rekapitulerar flera stadier av angiogenes. Time-lapse bilder av groning, lumen bildning, förgrening och anastomos – viktiga funktioner i angiogenes – visas.

Abstract

Angiogenes är en komplicerad process i flera steg, där, som svar på angiogena stimuli, nya fartyg skapas från den befintliga kärlbädden. Dessa åtgärder inkluderar: nedbrytning av basalmembranet, spridning och migration (spirande) av endotelceller (EG) i den extracellulära matrisen, anpassning av EG i sladdar, förgrening, lumen bildning, anastomos och bildandet av en ny basalmembranet. Många in vitro-tester har utvecklats för att studera denna process, men de flesta bara härma vissa skeden av angiogenes, och morfologiskt fartygen i analyserna ofta inte liknar fartygen in vivo. Baserat på tidigare arbeten av Nehls och Drenckhahn, har vi optimerat en in vitro-angiogenes test som använder mänskliga EG navelsträngen ven och fibroblaster. Denna modell rekapitulerar alla de viktigaste tidiga stadierna av angiogenes och, viktigare, fartyg visas patentet intercellulära lumen omgiven av polariserad EG. EG är belagda på cytodex microcarriers och inbäddad i en fibrin gel. Fibroblaster är skiktade ovanpå gelen där de ger nödvändiga lösliga faktorer som främjar EG groning från ytan av pärlorna. Efter flera dagar, många fartyg är närvarande som lätt kan observeras i faskontrast och time-lapse mikroskopi. Denna video visar de viktigaste stegen för att inrätta dessa kulturer.

Protocol

FÖRBEREDELSER CELLER Ta fram HUVEC och fibroblaster i M199/10% FBS / Pen-streptokock (1:100) 1-2 dagar innan beading. Växla medellång till EGM-2 (Clonetics) dagen innan beading för HUVEC och dagen före bädda för fibroblaster. En koncentration av ~ 400 HUVEC per pärla behövs. 20.000 fibroblaster per brunn behövs. Beläggning pärlor med HUVEC – DAG -1 Trypsinize HUVEC. Låt kulor för att reglera (DO Centrifugera inte…

Discussion

Det finns en växande konsensus om att tredimensionella (3D) in vitro-angiogenes-analyser ger en modell som är mycket närmare den verkliga miljön in vivo än vad som kan uppnås med hjälp av 2D-kulturer. Det är uppenbart att överlägsen 3D-system ska vara reproducerbar, och kunna härma flera av de viktigaste stegen i angiogenes. Även om flera tidigare 3D-analyser har utvecklats, många av dessa använder antingen är svåra att få mikrovaskulära celler, eller bara sammanfatta några av de etapper. I denna video beskriver vi och ut…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Cytodex-3 Beads	Reagent	Amersham Pharmacia	17-0485-01	10 g/bottle. 1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker. 2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL). 3. Discard the PBS and replace with fresh PBS: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL 4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote). 5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C. 6. Store it at 4C.
Aprotinin	Reagent	Sigma	A-1153	10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C.
Fibrinogen Type I	Reagent	Sigma	F-8630	1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS Note clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex. Sterile filter through 0.22 um
Thrombin	Reagent	Sigma	T-3399	22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C.