でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em
Summary
空間固有のフィトクロム応答の分子基盤は、組織および器官特異的フィトクロムの欠陥を示すトランスジェニック植物を用いて検討されている。マイクロアレイ解析に続いてソート蛍光活性化細胞により誘導されるフィトクロム発色団の枯渇を示す特定の細胞の単離は、空間的な固有のフィトクロム反応に関与する遺伝子を同定するために活用されています。
Abstract
光を媒介する植物のライフサイクルを通じての発達と適応のプロセスの配列。植物は光受容体が感知し、光に適応するために呼ばれる光吸収分子を利用する。赤色/遠赤色光吸収フィトクロム光受容体が広く研究されている。フィトクロムは、彼らが研究されている、すべての高等植物のシステムで異なると重複する機能を持つ蛋白質の家族として存在<sup> 1</sup>。種子の発芽から開花と老化の範囲フィトクロムを介した光反応は、しばしば特定の植物組織または器官に局在している<sup> 2</sup>。変異の分析を通じて、個々と冗長なフィトクロム機能の発見と解明にもかかわらず、photoperceptionと空間固有のフィトクロム応答を仲介するフィトクロムのローカライズされたプールの分子メカニズムの異なるサイトでの決定的な報告は限られている。我々は、フィトクロムphotoperceptionの特定の部位は組織や光形態形成の臓器特異的な側面、およびそのローカライズされたフィトクロムプールは細胞間のシグナル伝達の下流の標的遺伝子の異なるサブセットを従事を調節することが仮説に基づいて実験を設計した。我々は、選択的臓器、またはトランスジェニック植物内で組織特異的に機能的なフィトクロムを減らすために生化学的アプローチを開発した。我々の研究は、転写活性化因子GAL4による上流活性化配列（UAS）の要素の制御下にある遺伝子の発現のトランスをもたらすことが二部エンハンサートラップのアプローチに基づいています<sup> 3</sup>。ビリベルジン還元酵素（<em> BVR</em> UASの制御下にある）遺伝子は、黙ってUAS – BVRの親のGAL4トランス活性化のない状態で維持されている<sup> 4</sup>。 UAS – BVRトランスジェニックラインとの特異的発現のGAL4 – GFPエンハンサートラップラインの結果との間の遺伝的交雑<em> BVR</emによってマークされた細胞の>遺伝子<em> GFP</em>表現<sup> 4</sup>。フィトクロム発色団欠乏症におけるシロイヌナズナの結果でBVRの蓄積<em>植物体の</em<sup> 5月7日</sup>。従って、我々が生産されていることをトランスジェニック植物は、GAL4 -依存性の活性化を示す<em> BVR</em>フィトクロムの生化学的不活性化で得られた遺伝子だけでなく、GAL4依存<em> GFP</em>表現。の光生物学と分子遺伝学的解析<em> BVR</em>トランスジェニックラインでは、組織とphotoperceptionの対応する部位に関連付けられている臓器特異的なフィトクロムを介する応答への洞察を生み出している<sup> 4、7、8</sup>。 GFP陽性の蛍光活性化細胞選別（FACS）、エンハンサートラップによって誘導される<em> BVR</emマイクロアレイ解析を通じて、細胞型特異的遺伝子発現プロファイリングと相まって>発現植物プロトプラストは、空間的な固有のフィトクロム反応を媒介に関与推定下流の標的遺伝子を同定するために使用されています。この研究は、様々な組織や器官が光によって調節された植物の成長と発展に協力するメカニズム、光覚の部位の我々の理解を拡大し、複雑なフィトクロムを介した細胞間のシグナル伝達カスケードの分子解剖を進めています。
Protocol
Discussion
マイクロアレイ（1）を介して遺伝子発現プロファイリングは、11規制シロイヌナズナ実生の遺伝子の30％以上が光であることが分かっていますし、（2）、13フィトクロムシグナル伝達カスケード12に関与する光シグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子の広大なグループを特定している。そのような実験は、光が遺伝子発現の急激かつ長期的変化を誘導することを示…
Acknowledgements
植物のフィトクロム反応にモンゴメリーラボでの作業は、国立科学財団（助成金BLMにない。MCB – 0919100）と化学科学、地球科学およびバイオサイエンス部門、基礎エネルギー科学局、科学局、米国エネルギー省によってサポートされていますエネルギー（BLMへの助成金がない。DE FG02 91ER20021）。我々は共焦点の支援のためのシロイヌナズナプロトプラストの選別と博士メリンダフレームのプロトコルをソート蛍光活性化細胞の開発と最適化を支援するため博士はルイ王、実験的な援助のために、ステファニーコスティガンを撮影中に技術支援のためにメリッサウィテカーを感謝し、批判的に原稿を読んで顕微鏡。我々は編集支援のためのグラフィカルな設計の支援とカレンの鳥のためにマレーネキャメロンに感謝。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | ||
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | MSPC 0930 | ||
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma | G5768 | ||
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | PTC 001 | ||
| MES, low moisture content | Sigma | M3671 | ||
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | ||
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | ||
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
References
- Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
- Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
- Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
- Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , .
- Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
- Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
- Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , .
- Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
- Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
- Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
- Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
- Ulm, R., &, N. a. g. y., F, . Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
- Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
- Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. h. o. r. y., J, . Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
- Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
