La investigación de los tejidos y órganos específicos de las respuestas fitocromo usando FACS asistida por células de tipo Perfiles de expresión específica en Arabidopsis thaliana</em
Summary
La base molecular de las respuestas específicas de espacio-fitocromo está siendo investigado el uso de plantas transgénicas que presentan los tejidos y órganos específicos deficiencias fitocromo. El aislamiento de células específicas exhibir agotamiento inducido cromóforo fitocromo por fluorescencia de células activadas clasificación seguido por análisis de microarrays se está utilizando para identificar genes implicados en el espacio-las respuestas específicas de fitocromo.
Abstract
Media luz una serie de procesos de desarrollo y de adaptación a través del ciclo de vida de una planta. Las plantas utilizan la luz que absorben las moléculas llamadas fotorreceptores para percibir y adaptarse a la luz. El rojo / rojo lejano que absorbe la luz fotorreceptores fitocromo se han estudiado ampliamente. Fitocromos existir como una familia de proteínas con diferentes funciones y la superposición de todos los sistemas de plantas superiores en las que se han estudiado<sup> 1</sup>. Fitocromo las respuestas mediadas por la luz, que van desde la germinación de las semillas a través de la floración y la senescencia, a menudo se localiza en los tejidos u órganos específicos de la planta<sup> 2</sup>. A pesar del descubrimiento y la elucidación de las funciones de fitocromo individual y redundante a través de análisis mutacional, informes concluyentes en sitios distintos de photoperception y los mecanismos moleculares de las piscinas localizadas de fitocromos espaciales que median las respuestas específicas fitocromo son limitados. Hemos diseñado experimentos basados en la hipótesis de que los sitios específicos de photoperception fitocromo regula los tejidos y órganos específicos aspectos de fotomorfogénesis, y que las piscinas fitocromo localizada participar distintos subgrupos de genes blanco abajo en la señalización de célula a célula. Hemos desarrollado un enfoque bioquímico para reducir selectivamente fitocromos funcional de un órgano o tejido específico dentro de las plantas transgénicas. Nuestros estudios se basan en un potenciador del bipartito-trampa de enfoque que se traduce en la transactivación de la expresión de un gen bajo el control de la secuencia ascendente de activación (UAS) por el elemento activador transcripcional GAL4<sup> 3</sup>. La biliverdina reductasa (<em> BVR</em> Gen) bajo el control de la UAS se mantuvo en silencio ante la ausencia de transactivación GAL4 en el padre UAS-BVR<sup> 4</sup>. Cruces genéticos entre una línea UAS-BVR transgénicos y un GAL4-GFP trampa potenciador resultado en la línea de expresión específica de la<em> BVR</em> Gen en las células marcadas por<em> GFP</em> Expresión<sup> 4</sup>. BVR acumulación en los resultados de las plantas de Arabidopsis en la deficiencia de cromóforo fitocromo<em> En la planta</em<sup> 5.7</sup>. Por lo tanto, las plantas transgénicas que se han producido exhibición GAL4-dependiente de la activación de la<em> BVR</emGen>, lo que resulta en la inactivación del fitocromo bioquímicos, así como GAL4-dependiente<em> GFP</em> Expresión. Los análisis genéticos y moleculares de fotobiológicos<em> BVR</em> Líneas transgénicas están dando idea de los tejidos y órganos específicos fitocromo respuestas mediadas que se han asociado con los sitios correspondientes de photoperception<sup> 4, 7, 8</sup>. Fluorescencia de células activadas por la clasificación (FACS) de la GFP-positivo, potenciador trampa inducida<em> BVR</em> Expresan protoplastos de la planta junto con células de tipo específico de perfiles de expresión génica a través de análisis de microarrays se utiliza para identificar putativo genes diana posterior implicados en la mediación espacial de las respuestas específicas fitocromo. Esta investigación se está expandiendo nuestro conocimiento de los lugares de percepción de la luz, los mecanismos mediante los cuales los distintos tejidos u órganos colaborar en el crecimiento de plantas de luz regulada y desarrollo, y avanzar en la disección molecular de los complejos fitocromo mediada por la célula a célula de cascadas de señalización.
Protocol
Discussion
Perfiles de expresión génica mediante microarrays (1) ha indicado que más del 30% de los genes en plantas de Arabidopsis se regula la luz 11 y (2) ha identificado un vasto grupo de genes que codifican proteínas de transducción de señales de luz que participan en la cascada de señalización fitocromo 12, 13 . Estos experimentos sugieren que la luz induce cambios rápidos y de largo plazo en la expresión génica. Cada grupo de fitocromos puede controlar sólo un subconjunto de respuestas de d…
Acknowledgements
El trabajo en el laboratorio de Montgomery sobre las respuestas de fitocromo en las plantas es apoyada por la National Science Foundation (subvención no. MCB-0919100 de BLM) y Ciencias Químicas, Geociencias y Ciencias Biológicas de la División de la Oficina de Ciencias Básicas de Energía, Oficina de Ciencia, EE.UU. Departamento de Energía (concesión no. FG02 DE 91ER20021 a BLM). Damos las gracias a Melissa Whitaker para la asistencia técnica durante el rodaje y la lectura crítica del manuscrito, Stephanie Costigan de asistencia experimental, el Dr. Luis Rey de asistencia con el desarrollo y la optimización de fluorescencia de células activadas clasificación protocolos para la clasificación de protoplastos de Arabidopsis y Marco Dra. Melinda ayuda con confocal microscopía. Damos las gracias a Marlene Cameron para asistencia en el diseño gráfico y de aves Karen por su asistencia editorial.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | ||
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | MSPC 0930 | ||
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma | G5768 | ||
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | PTC 001 | ||
| MES, low moisture content | Sigma | M3671 | ||
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | ||
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | ||
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
References
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