Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em
Summary
De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.
Abstract
Licht bemiddelt een scala van ontwikkelings-en adaptieve processen in de levenscyclus van een plant. Planten gebruiken licht-absorberende moleculen, de zogenaamde fotoreceptoren te voelen en aan het licht aan te passen. De rood / ver-rood licht-absorberende fytochroom fotoreceptoren zijn uitgebreid bestudeerd. Phytochromes bestaan als een familie van eiwitten met verschillende en overlappende functies in alle hogere plant systemen waarin ze zijn bestudeerd<sup> 1</sup>. Fytochroom-gemedieerde lichte reacties, die variëren van zaadkieming tot bloei en senescentie, zijn vaak gelokaliseerd in specifieke plant weefsels of organen<sup> 2</sup>. Ondanks de ontdekking en de opheldering van de individuele en redundante fytochroom functies door mutatie-analyses, sluitend rapporten over verschillende sites van photoperception en de moleculaire mechanismen van gelokaliseerde poelen van phytochromes die bemiddelen ruimtelijk-specifieke fytochroom reacties zijn beperkt. We ontwierpen experimenten op basis van de hypothesen die specifieke sites van fytochroom photoperception regelen weefsel-en orgaan-specifieke aspecten van fotomorfogenese, en dat de lokale fytochroom zwembaden gaan verschillende subsets van de downstream-doelwitgenen in cel-cel signalering. We ontwikkelden een biochemische benadering om selectief functionele phytochromes te verminderen in een orgaan-of weefsel-specifieke wijze binnen transgene planten. Onze studies zijn gebaseerd op een tweedelige versterker-trap aanpak die resulteert in transactivatie van de expressie van een gen onder controle van de Upstream Activatie Sequence (UAS) element door de transcriptionele activator GAL4<sup> 3</sup>. De biliverdine reductase (<em> BVR</em>) Gen onder de controle van de UAS wordt stil gehouden in de afwezigheid van GAL4 transactivatie in de UAS-BVR ouder<sup> 4</sup>. Genetische kruisingen tussen een UAS-BVR transgene lijn en een GAL4-GFP enhancer trap lijn resulteren in bijzondere uitdrukking van het<em> BVR</em> Gen in cellen gekenmerkt door<em> GFP</em> Uitdrukking<sup> 4</sup>. BVR accumulatie in Arabidopsis-planten resulteert in fytochroom chromofoor tekort<em> In planta</em<sup> 5-7</sup>. Zo, transgene planten die we hebben vertonen GAL4-afhankelijke activering van de geproduceerde<em> BVR</em> Gen, resulterend in de biochemische inactivatie van fytochroom, evenals GAL4-afhankelijke<em> GFP</em> Expressie. Fotobiologische en moleculair genetische analyse van<em> BVR</em> Transgene lijnen worden waardoor inzicht in de weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom-gemedieerde reacties die in verband zijn gebracht met de bijbehorende sites van photoperception<sup> 4, 7, 8</sup>. Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) van GFP-positieve, enhancer-trap-geïnduceerde<em> BVR</em>-Expressie plantenprotoplasten gekoppeld aan cel-type-specifieke gen expressie profilering door middel van microarray-analyse wordt gebruikt om de vermeende downstream doelwit genen die betrokken zijn bij het bemiddelen ruimtelijk-specifieke fytochroom reacties te identificeren. Dit onderzoek is de uitbreiding van onze kennis van de gebieden van het licht waarnemen, de mechanismen waardoor verschillende weefsels of organen samen te werken in het licht-gereguleerde planten groei en ontwikkeling, en het bevorderen van de moleculaire dissectie van complexe fytochroom-gemedieerde cel-cel signalering cascades.
Protocol
Discussion
Gen expressie profilering door middel van microarrays (1) heeft uitgewezen dat meer dan 30% van de genen in Arabidopsis zaailingen zijn licht gereguleerd 11 en (2) heeft een grote groep genen die coderen voor licht signaaltransductie eiwitten betrokken bij de fytochroom signaalcascade 12, 13 . Dergelijke experimenten suggereren dat licht een snelle en lange-termijn veranderingen in genexpressie induceert. Elke pool van phytochromes mag alleen van een subset van ontwikkelings-en adaptieve reacties. …
Acknowledgements
Werk in de Montgomery lab op fytochroom reacties in planten wordt ondersteund door de National Science Foundation (subsidie niet. MCB-0919100 naar BLM) en de Chemische Wetenschappen, Geowetenschappen en Biosciences Division, Bureau van Basic Energy Sciences, Office of Science, het Amerikaanse ministerie van energie (subsidie niet. DE FG02 91ER20021 naar BLM). Wij danken Melissa Whitaker voor technische bijstand tijdens het filmen en kritisch lezen van het manuscript, Stephanie Costigan voor experimentele bijstand, dr. Louis King voor hulp bij het ontwikkelen en optimaliseren van fluorescentie-Activated Cell Sorting protocollen voor Arabidopsis protoplast sorteren en dr. Melinda Frame voor hulp bij confocale microscopie. Wij danken Marlene Cameron voor grafische vormgeving bijstand en Karen Vogel voor redactionele ondersteuning.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | ||
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | MSPC 0930 | ||
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma | G5768 | ||
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | PTC 001 | ||
| MES, low moisture content | Sigma | M3671 | ||
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | ||
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | ||
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
References
- Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
- Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
- Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
- Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , .
- Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
- Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
- Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , .
- Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
- Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
- Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
- Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
- Ulm, R., &, N. a. g. y., F, . Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
- Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
- Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. h. o. r. y., J, . Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
- Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
