ऊतक में पशु कैप (अधिनियम) प्रत्यारोपण परख का प्रयोग निर्धारण Xenopus laevis</em
Summary
पशु टोपियां overexpressing जीन उत्पाद (ओं) को विकसित करने की दिशा में प्रत्यारोपित कर रहे हैं<em> Xenopus laevis</em> भ्रूण क्रम में स्थापित करने के लिए कि क्या ऊतक निर्धारित किया जाता है.
Abstract
कई प्रोटीन भ्रूण के विकास में एक दोहरी भूमिका निभाते हैं. जो कि एक विशिष्ट ऊतकों में सेल भाग्य निर्धारण को विनियमित भी भ्रूण के एक बड़े क्षेत्र के विकास को प्रभावित कर सकते हैं. यह एक विशेष ऊतकों में अपनी भूमिका के विश्लेषण करने के लिए मुश्किल को परिभाषित करता है. उदाहरण के लिए,<em> नोगिन</em> Overexpression<em> Xenopus laevis</em> भ्रूण आँख सहित पूरे पूर्वकाल क्षेत्र के विस्तार का कारण बनता है,<sup1,2></sup>. इस परिणाम से, यह ज्ञात नहीं है अगर नोगिन तंत्रिका ऊतक का एक विस्तार के कारण आँख निर्धारण या कि में एक प्रत्यक्ष भूमिका निभाता है, नोगिन परोक्ष रूप से आंख गठन को प्रभावित करता है. इस जटिल phenotype होने सेल भाग्य निर्धारण में अपनी आंख विशेष भूमिका का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल का अध्ययन करता है. हम एक परख है कि इस समस्या पर काबू पा विकसित किया है. के pluripotent प्रकृति का लाभ उठाते हुए<em> Xenopus laevis</em> पशु टोपी<sup> 3</sup> हम एक जीन उत्पाद (ओं) की क्षमता का परीक्षण परख विकसित किया है की तरह,<em> नोगिन</em> या आंख क्षेत्र प्रतिलेखन कारकों (EFTFs), विशेष रूप से ऊतक या प्रकार की कोशिकाओं में भ्रूण के किनारे पर इस ऊतक प्रत्यारोपण द्वारा टोपी बदलने के लिए<sup> 4</sup>. हालांकि हमने पाया है या तो नोगिन प्रोटीन प्रतिलेखन कारकों के उपचार या एक संग्रह पशु टोपी में रेटिना सेल भाग्य का निर्धारण कर सकते हैं, इस प्रक्रिया के लिए जीन उत्पाद (ओं) अन्य ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से निर्दिष्ट में शामिल की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Discussion
इस वीडियो में, हम क्लासिक Xenopus जीव द्वारा इस्तेमाल की तकनीक है, जो हम जानवर टोपी प्रत्यारोपण परख बनाने पुनर्व्यवस्थित के हमारे संस्करण का प्रदर्शन किया है . कमरे के तापमान पर, Xenopus भ्रूण चरणों 9 और 15 क?…
Acknowledgements
इस काम में अनुसंधान अनुदान से दृष्टिहीनता (कैरियर MEZ और ASV तक विकास पुरस्कार और नेत्र विज्ञान विभाग के लिए एक अप्रतिबंधित अनुदान), ई. Matilda Zeigler (MEZ और ASV) फाउंडेशन और राष्ट्रीय नेत्र संस्थान / (एनआईएच MEZ रोकें द्वारा समर्थित किया गया R01EY015748 और R01EY017964 अनुदान).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems/Ambion | AM1340 | ||
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc | 27-30-1 | ||
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instruments, Inc. | P-97 | ||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher | BW17-528Z | ||
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher | NC9644388 | ||
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0160 | ||
| human chorionic gonadotropin | Intervet | 22219 | ||
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | ||
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher | 11-680-21 | ||
| Transfer pipette | Krackeler | 6290-20635A | ||
| Dumostar #5 Forceps | Fisher | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
