자수 성 가한 Cytospin 장치를 사용하여 인간 Pluripotent 줄기 세포의 Immunocytochemical 분석
Summary
세포 – 표면 마커에 대한 인간의 pluripotent 줄기 세포의 중지 immunocytochemical 얼룩 (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4)가 관측 및 부량에 대한 세포 monolayer을 생성하기 위해 스스로 만든 cytospin 장치의 사용을 기반으로 달성했다.
Abstract
인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 인간의 유도 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs)를 포함 인간 pluripotent 줄기 세포 (hPSCs)은 무한한 자기 갱신 기능 및 여러 세포 유형으로 구별하기 위해 잠재적으로 인해 흥미로운 셀 소스입니다. hPSCs의 pluripotent 상태는 일반적 qPCR, immunocytochemistry 같은 방법으로 평가, 그리고 기타로<em> 체외에서</em>과<em> 생체내에</em여러 세포 유형으로> 차별화 전략. 이러한 가운데, immunocytochemical 기법 후보 세포 및 세포 – 표면 생체 분석을 바탕으로 hPSCs의 undifferentiated 상태를 일상적인 특성화를 위해 개발되었습니다. 식민지 문제는 일상적인 기준으로 개별 세포 수준에서 이러한 마커의 표현을 quantifying의 발생으로 hPSCs 성장했다는 사실 감안할 때. 유동세포계측법 분석이 문제를 해결하지만, 필요 셀 번호 및 hPSC 문화의 일상적인 품질 관리 평가 정상적으로 도움이되는 없습니다 시약의 사용에 제공하고 있습니다. 따라서, 마커 평가에 대한 보존 무결성과 monolayer 세포 샘플을 만드는 실용적이고 재현할 방법의 개발은 줄기 세포 연구에 많은 장점이 있습니다. monolayer에서 개별 세포를 쉽게 관찰 및 특정 마커의 표현에 대한 계량 수 있기 때문에 이것은 크게 immunocytochemical 분석 혜택을 제공합니다. 이 목표는 자수 성 가한 cytospin 장치가 건설되었으며 immunocytochemical 얼룩와 함께 사용하기위한 최적화된. 두 세포 표면 마커 (SSEA3/SSEA4) 표현이 프로토콜의 목적을 위해 변형 BG01의 줄기 세포 라인에서 분석했다.
Protocol
Discussion
우리 연구소의 목적을 위해, 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEFs)에 성장 줄기 세포 문화 35mm 요리가 cytospin 장치와 함께 사용하기위한 immunocytochemical 얼룩 절차에 할당된 것입니다. 세포는 다음 단일 세포 현탁액에, 가능한 한 MEF 층의 제거, passaging 효소에 의해 수집됩니다. MEF 계층에서 더 효과적으로 줄기 세포 격리가 필요한 경우, 식민지를 수동으로 정지에 소화 다음 포착 수 있습니다. 피더 무료 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에 대한 부분적인 자금은 NSF – 경력 0,744,556 (라오)와 VCU – HHMI 과학 교육 및 연구 프로그램 (파스쿠알)을 통해 장학금에 의해 제공되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Lab Tek Permanox Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 117437 | Material for re-used plastic slides | |
| Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| 0.1-10μL Filter Tips | USA Scientific | 1121-3810 | ||
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 120542-B | ||
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | Mounting Medium | |
| DPBS | Gibco | 14190 | ||
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 10000C | ||
| Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4304 | Primary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4303 | Primary Antibody for SSEA-3 staining | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11029 | Secondary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11006 | Secondary Antibody for SSEA-3 staining | |
| DAPI, Dihydrochloride | CalBioChem | 268298 |
References
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. – Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).
