Self-Made sitospin Aparatı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücre İmmünositokimyasal Analizi

Summary

Gözlem ve ölçümü için bir tek tabaka hücreleri oluşturmak için bir self-made sitospin cihazların kullanımı dayalı, insan pluripotent kök hücreleri hücre yüzey belirteçleri için Süspansiyon immünositokimyasal boyama (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4) elde edildi.

Abstract

Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) sınırsız kendini yenileme yetenekleri ve çok sayıda hücre tipleri ayırt etmek için potansiyel nedeniyle heyecan verici hücre kaynaklarıdır. HPSCs pluripotent devlet qPCR, immünsitokimya gibi teknikler genellikle değerlendirilen ve diğer<em> In vitro</em> Ve<em> In vivo</em> Birden çok hücre tiplerine farklılaşma stratejileri. Bunlar arasında, immünositokimyasal teknikleri aday hücre içi ve hücre yüzeyi biyobelirteçleri analizine dayalı hPSCs farklılaşmamış devletin rutin karakterizasyonu için geliştirilmiştir. Koloniler, sorunları rutin olarak tek tek hücre düzeyinde bu belirteçlerin ifade nicel olarak ortaya çıkan hPSCs büyüdüğünü göz önüne alındığında. Flow sitometri analizleri, bu sorunu ancak hücre sayıları ve normal, hPSC kültürlerin rutin kalite kontrol değerlendirmesi için elverişli değildir reaktifler kullanımı için hizmet vermektedir. Böylece, belirteç değerlendirilmesi için bütünlüğü korunmuş tek tabaka hücre örnekleri oluşturmak pratik ve tekrarlanabilir araçlarının geliştirilmesi, kök hücre araştırmaları pek çok avantajı vardır. Tek tek hücrelerin tek tabaka kolayca gözlenir ve spesifik belirteçler ifade için nicel olabilir, çünkü bu, immünositokimyasal analiz büyük ölçüde yarar sağlar. Bu hedefe doğru, self-made sitospin aparat inşa edildi ve immünositokimyasal boyama ile kullanım için optimize edilmiş. İki hücre yüzey belirteçleri (SSEA3/SSEA4) ifadesi için bir varyantı BG01 Bu protokolün amacı, kök hücre hattı analiz edildi.

Protocol

Bölüm 1: Süspansiyon İmmünositokimyasal Boyama Hücreler tek bir hücre süspansiyonu hasat edilir. Bu hücreler daha sonra 1.5 2mL mikrosantrifüj tüpler aktarılır ve 200g 4 dakika santrifüj. Hücreler supernatant dışarı aspire tarafından yıkanır, PBS 1mL yeniden askıya – (Mg 2 olmadan + ve Ca 2 +) ve sonra 4 dakika için 200 gr tekrar santrifüj. Bu iki kez yapılmalıdır. Yıkadıktan sonra, hücreler daha sonra yeniden askıya…

Discussion

Laboratuvar amaçları için, 35mm, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yetişen kök hücre kültürleri bir çanak immünositokimyasal boyama prosedürü için sitospin aparatı ile kullanım için ayrılmıştır. Hücreler daha sonra bir tek hücre süspansiyonu, MEF katmanı mümkün olduğu kadar çok kaldırarak, Pasajlanması enzimatik yoluyla tahsil edilir. MEF katman daha etkili kök hücre izolasyonu isteniyorsa, koloniler elle süspansiyon içine sindirilmiş sonra aldı olabilir. Besleyici ücretsiz koşul…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Lab Tek Permanox Chamber Slide		Thermo Fisher Scientific	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned		Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips		USA Scientific	1121-3810
Microscope Cover Glass		Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280		Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS		Gibco	14190
Normal Goat Serum		Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride		CalBioChem	268298