Analisi immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti usando un Self-Made Apparato Cytospin

Summary

Sospensione colorazione immunocitochimica di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per la superficie cellulare marcatori (SSEA-3/SSEA-4) è stato raggiunto sulla base di utilizzo di un self-made apparato cytospin per creare un monostrato di cellule per l'osservazione e la quantificazione.

Abstract

Cellule staminali pluripotenti (hPSCs) che includono cellule staminali embrionali umane (hESC) e umani cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) sono fonti di cellule eccitante a causa della loro illimitata capacità di auto-rinnovamento e il loro potenziale di differenziarsi in tipi cellulari diversi. Lo stato pluripotente di hPSCs è tipicamente valutata mediante tecniche come qPCR, immunocitochimica, e da altri<em> In vitro</em> E<em> In vivo</em> Strategie di differenziazione in tipi di cellule diverse. Tra questi, tecniche immunocitochimiche sono state sviluppate per la caratterizzazione di routine dello stato indifferenziato di hPSCs sulla base di analisi di biomarcatori candidato intracellulare e superficie cellulare. Dato il fatto che hPSCs crescere come colonie, i problemi sorgono nel quantificare l'espressione di questi marcatori a livello cellulare individuali su base di routine. Analisi di citometria a flusso servire per risolvere questo problema, ma richiedono numero di cellule e l'utilizzo di reagenti che non sono normalmente favorevole per la valutazione di routine di controllo di qualità di colture hPSC. Così, lo sviluppo di mezzi pratici e riproducibile di creare campioni di cellule monostrato con integrità preservata per la valutazione marcatore ha molti vantaggi nel campo della ricerca sulle cellule staminali. Questo benefici notevolmente l'analisi immunocitochimica perché le cellule individuali dal monostrato può essere facilmente osservato e quantificato per l'espressione di marcatori specifici. Verso questo obiettivo, un self-made cytospin apparato è stato costruito e ottimizzato per l'utilizzo con colorazione immunocitochimica. Due marcatori di superficie cellulare (SSEA3/SSEA4) espressione sono stati analizzati in una linea di cellule staminali variante BG01 ai fini di questo protocollo.

Protocol

Parte 1: Sospensione colorazione immunocitochimica Le cellule sono raccolte in una sospensione di cellule singole. Le cellule sono poi trasferiti in 1,5-microcentrifuga da 2 ml tubi e centrifugati a 200g per 4 minuti. Le cellule sono lavate aspirando fuori surnatante, risospesi in 1 ml di PBS – (senza Mg 2 + e Ca 2 +) e poi centrifugati nuovamente a 200g per 4 minuti. Questo dovrebbe essere fatto due volte. Dopo il lavaggio, le cellule vengono poi fissati da…

Discussion

Ai fini del nostro laboratorio, un piatto di 35 mm di colture di cellule staminali coltivate su fibroblasti embrionali del mouse (MEF) è assegnato per la procedura di colorazione immunocitochimica per l'utilizzo con l'apparecchio cytospin. Le cellule sono poi raccolti tramite enzimatica passaging, eliminando quanto più dello strato MEF possibile, in una cella singola sospensione. Se è più efficace isolamento delle cellule staminali dallo strato MEF si desidera, le colonie possono essere raccolte manualmente …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Lab Tek Permanox Chamber Slide		Thermo Fisher Scientific	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned		Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips		USA Scientific	1121-3810
Microscope Cover Glass		Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280		Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS		Gibco	14190
Normal Goat Serum		Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride		CalBioChem	268298