セルフメイドサイトスピン装置を用いてヒト多能性幹細胞の免疫細胞化学的解析
Summary
細胞表面マーカー（SSEA-3/SSEA-4）のためのヒト多能性幹細胞（hPSCs）の懸濁液を免疫細胞化学染色を観察し、定量化のための細胞の単層を作成するために自作サイトスピン装置の使用に基づいて達成された。
Abstract
ヒト胚性幹細胞（ヒトES）とヒトの人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含むヒト多能性幹細胞（hPSCsは）彼らの無限の自己複製機能と、複数の細胞型に分化する潜在能力に起因する刺激的な細胞源です。 hPSCsの多能性状態は、典型的には、定量PCR、免疫細胞化学などの手法によって評価され、その他で<em> in vitroで</em>と<em> in vivoで</em複数の細胞型へ>差別化戦略。これらの中でも、免疫細胞化学的手法は、候補細胞内および細胞表面マーカーの分析に基づいてhPSCsの未分化状態の日常的特性評価のために開発されている。 hPSCsがコロニーとして成長しているという事実を考えると、問題は定期的に個々の細胞レベルでこれらのマーカーの発現を定量化するに生じる。フローサイトメトリー分析は、この問題に対処するが、細胞数を必要とし、通常はhPSC文化の日常的な品質管理の評価のための助長ではない試薬を使用するのに役立つ。このように、マーカーの評価のために保存整合性と単層の細胞サンプルの作成の実践的かつ再現可能な手段の開発は、幹細胞研究の多くの利点があります。単分子層からの個々の細胞が容易に特定のマーカーの発現について観察し、定量化できるため、これは大幅に免疫細胞化学的分析に利益をもたらします。この目標に向けて、自作サイトスピン装置が建設され、免疫細胞化学染色の使用に最適化。二つの細胞表面マーカー（SSEA3/SSEA4）式は、このプロトコルの目的のためにバリアントBG01の幹細胞株で分析した。
Protocol
Discussion
私たちの研究室の目的のためには、マウス胚性繊維芽細胞（MEF）上に成長させた幹細胞培養の35mmディッシュは、サイトスピン装置で使用するための免疫細胞化学染色の手続きのために割り当てられます。その後、細胞を単一細胞懸濁液に、可能な限りMEF層のを除去する、継代酵素によって収集されます。 MEFの層から、より効果的な幹細胞の分離が必要な場合は、コロニーを手動で懸濁液に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事のための資金の一部は、NSF – CAREER 0744556（ラオ）とVCU – HHMI科学教育研究プログラム（パスク）を通じて、奨学金によって提供されていました。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Lab Tek Permanox Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 117437 | Material for re-used plastic slides | |
| Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| 0.1-10μL Filter Tips | USA Scientific | 1121-3810 | ||
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 120542-B | ||
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | Mounting Medium | |
| DPBS | Gibco | 14190 | ||
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 10000C | ||
| Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4304 | Primary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4303 | Primary Antibody for SSEA-3 staining | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11029 | Secondary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11006 | Secondary Antibody for SSEA-3 staining | |
| DAPI, Dihydrochloride | CalBioChem | 268298 |
References
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. – Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).
