人多能干细胞的免疫组织化学分析，使用自制Cytospin器械
Summary
暂停人类多能干细胞的细胞表面标记的免疫细胞化学染色（hPSCs）（SSEA-3/SSEA-4）是实现的基础上使用自制的cytospin设备创建一个观察和定量细胞单层。
Abstract
人类多能干细胞（hPSCs），包括人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）和人类诱导多能干细胞（人iPS细胞）是令人兴奋的细胞来源，由于其无限的自我更新能力和分化成多种细胞类型的潜力。 hPSCs多能状态是典型的评估，如定量PCR，免疫细胞化学技术，以及其他<em>在体外</em><em>在体内</em>分化成多种细胞类型的策略。其中，免疫细胞化学技术，已发展为候选人细胞内和细胞表面的生物标志物的分析为基础的未分化状态的hPSCs的常规鉴定。鉴于hPSCs增长殖民地，问题出现在例行的基础上的单个细胞水平上量化这些标志物的表达。流式细胞仪分析服务来解决这个问题，但需要手机号码，使用的试剂通常不利于为常规质量控制评估HPSC文化。因此，发展的创建与保存完整的标记评价的单层细胞样本的实际和可重复性的手段已在干细胞研究的许多优点。这大大有利于免疫细胞化学分析，因为从单个细胞的单层，可以很方便地观察和特定标记的表达量化。实现这一目标，cytospin自制仪器构造和使用免疫细胞化学染色进行了优化。两种细胞表面标志物（SSEA3/SSEA4）的表达进行了分析，在本议定书的目的，一个变种BG01干细胞株。
Protocol
Discussion
对于我们实验室的目的，对小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的干细胞成长的文化35毫米菜配发的免疫细胞化学染色程序与使用的cytospin仪器。酶传代细胞，然后收集，消除尽可能MEF层之多，成单细胞悬液。如果需要更有效地从MEF层干细胞的分离，菌落可手动挑选然后悬挂消化。如果馈线自由的条件下使用，在越来越多的干细胞培养的菌落可以简单地被刮掉，并悬挂消化。虽然最初的单细胞悬液，是理?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
为这项工作提供部分资金由美国国家科学基金会CAREER 0744556（RAO），通过在VCU的霍华德休斯医学研究所的科学教育和研究发展计划（帕斯夸尔）的奖学金。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Lab Tek Permanox Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 117437 | Material for re-used plastic slides | |
| Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| 0.1-10μL Filter Tips | USA Scientific | 1121-3810 | ||
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 120542-B | ||
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | Mounting Medium | |
| DPBS | Gibco | 14190 | ||
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 10000C | ||
| Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4304 | Primary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4303 | Primary Antibody for SSEA-3 staining | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11029 | Secondary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11006 | Secondary Antibody for SSEA-3 staining | |
| DAPI, Dihydrochloride | CalBioChem | 268298 |
References
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. – Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).
