Вывод Мышь трофобласта стволовых клеток из бластоцист

Summary

В этом видео, мы демонстрируем изоляции мыши бластоцисты и вывод трофобласта стволовых клеток из бластоцист. Мы также описаны условия содержания имущества стволовых клеток, а также индукцию дифференциации в культуре.

Abstract

Спецификация трофэктодермы является одним из самых ранних событий дифференциации развития млекопитающих. Трофобласта линии происходит от имплантации трофэктодермы посредником и генерирует плода часть плаценты. В результате развития этой линии имеет важное значение для выживания эмбриона. Вывод трофобласта стволовых (TS) клеток из бластоцист мыши была впервые описана Танака<em> Соавт.</em> 1998 год. Способность TS клетки сохранить трофобласта конкретных собственности и их выражение стадии и типа клеток-специфических маркеров после соответствующей стимуляции обеспечивает полноценную систему модель для развития трофобласта линии которой сводный ранние события плацентации. Кроме того, клетки трофобласта являются одним из нескольких типов клеток соматической в ​​естественных усиления генома. Хотя молекулярных путей, лежащий в основе трофобласта полиплоидизации начали распутывать, физиологическая роль и преимущество трофобласта усиления генома во многом остается неуловимым. Развития диплоидных клеток стволовых полиплоидных клеток трофобласта в культуре делает это<em> Исключая виво</em> Система отличным инструментом для выяснения механизма регулирования репликации генома и нестабильности в норме и патологии. Здесь мы опишем протокол, основанный на предыдущих докладах с модификацией опубликованной в Чиу<em> Соавт.</em> 2008 год.

Protocol

В этом протоколе описываются подготовка мыши бластоцисты и создание линии TS клетки. Генеральный манипуляции мышью до коллекцию бластоцисты, в том числе созданы для естественного спаривания и индукция супер овуляции, в основном следовать стандартным протоколом иллюстрируется Надь …

Discussion

В этом видео, мы демонстрируем процесс сбора E3.5 бластоцист из матки и экспериментальные процедуры установления TS клеточных линий. Мы также описываем условие для поддержания stemness ТС клеток и вызвать их дифференцировку в дифференцированных клеток. Два важных шагов для получения чистой …

Materials

Reagents

TS medium:
RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercaptoethanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C:
Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM):
Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 10⁶/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA:
Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x):
Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x):
Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).