Derivazione di cellule staminali trofoblasto mouse da blastocisti

Summary

In questo video, dimostriamo l'isolamento di blastocisti mouse e la derivazione di cellule staminali trofoblasto da blastocisti. Abbiamo anche descrivere le condizioni per il mantenimento della proprietà delle cellule staminali e l'induzione della differenziazione nella cultura.

Abstract

Specificazione del trophectoderm è uno degli eventi più antichi differenziazione di sviluppo dei mammiferi. Il lignaggio trofoblasto deriva dalla impianto trophectoderm media e genera la parte fetale della placenta. Di conseguenza, lo sviluppo di questo lignaggio è essenziale per la sopravvivenza dell'embrione. Derivazione di staminali trofoblasto (TS), le cellule da blastocisti mouse è stato descritto per primo da Tanaka<em> Et al.</em> 1998. La capacità delle cellule TS per preservare la proprietà specifica trofoblasto e la loro espressione di stage e cellule di tipo-specifici marcatori dopo la stimolazione adeguata fornisce un sistema valido modello per studiare lo sviluppo lignaggio trofoblasto cui ricapitolando eventi placentazione presto. Inoltre, le cellule trofoblasto sono uno dei pochi tipi di cellule somatiche in fase di amplificazione del genoma naturale. Anche se le vie molecolari alla base poliploidizzazione trofoblasto hanno cominciato a svelare, il ruolo fisiologico e il vantaggio di amplificazione del genoma trofoblasto rimane in gran parte sfuggente. Lo sviluppo delle cellule staminali in cellule diploidi trofoblasto poliploidi in cultura fa di questo<em> Ex vivo</emSistema di> un ottimo strumento per chiarire il meccanismo di regolazione della replicazione del genoma e l'instabilità nella salute e nella malattia. Qui si descrive un protocollo basato su precedenti rapporti con modificazioni pubblicato nel Chiu<em> Et al.</em> 2008.

Protocol

In questo protocollo, si descrive la preparazione di blastocisti mouse e la creazione di linee cellulari TS. Manipolazioni del mouse generale prima della raccolta di blastocisti, tra cui il set-up per la monta naturale e l'induzione dell'ovulazione super, in fondo, il protocollo standard illustrato da Nagy et al. 2003 (pp146-150). Derivazione e il mantenimento delle cellule TS Setup croce riproduzione tra i topi di interesse. Preparare fibroblasti embrio…

Discussion

In questo video, dimostriamo il processo per la raccolta E3.5 blastocisti dalle procedure di uteri e sperimentali per stabilire linee di cellule TS. Abbiamo anche descrivere la condizione per mantenere la staminalità delle cellule TS e per indurre la loro differenziazione in cellule differenziate. A due passi fondamentali per ottenere linee cellulari puro TS sono i tempi per la disaggregazione escrescenza (punto 9) e la lavorazione del primo passaggio (passo 11). E 'stato riportato che endoderma primitivo cellule d…

Materials

Reagents

TS medium:
RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercaptoethanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C:
Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM):
Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 10⁶/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA:
Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x):
Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x):
Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).