Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Zusammenfassung

In diesem Video zeigen wir die Isolierung der Maus Blastozysten und die Ableitung der Trophoblast-Stammzellen aus Blastozysten. Wir beschreiben auch Bedingungen für die Wartung der Stammzell-Eigenschaft sowie die Induktion der Differenzierung in Kultur.

Zusammenfassung

Spezifikation der Trophektoderm ist eine der frühesten Differenzierung Veranstaltungen von Säugetier-Entwicklung. Der Trophoblast Linie aus dem Trophektoderm vermittelt Implantation abgeleitet und generiert die fetalen Teil der Plazenta. Als Ergebnis ist die Entwicklung dieser Linie wichtig für den Embryo Überleben. Herleitung der Trophoblasten Stammzellen (TS)-Zellen von Maus Blastozysten wurde zuerst von Tanaka beschrieben

Protokoll

In diesem Protokoll, beschreiben wir die Herstellung von Maus-Blastozysten und die Einrichtung von TS-Zelllinien. Allgemeine Maus Manipulationen vor der Sammlung von Blastozysten, einschließlich der Einrichtung für die natürliche Paarung und die Induktion von Super Eisprung folgen grundsätzlich dem Standard-Protokoll von Nagy et al dargestellt. 2003 (pp146-150).

Ableitung und Wartung von TS-Zellen

1. Setup-Zucht Kreuzung zwischen Mäusen von Interesse.
2. Bereiten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) als Feeder-Zellen. Zwei Tage vor der Sammlung von Blastozysten, MEFs (2 x 10 ⁶ Zellen) werden in 100 mm-Sc....

Diskussion

In diesem Video zeigen wir, den Prozess zu E3.5 Blastozysten aus uteri und experimentellen Verfahren zu sammeln, um TS-Zelllinien zu etablieren. Wir beschreiben auch die Voraussetzung für die Stammzell-Seins der TS-Zellen zu erhalten und deren Differenzierung in differenzierten Zellen zu induzieren. Zwei entscheidende Schritte zur reinen TS-Zelllinien zu erhalten sind das Timing für Auswuchs Disaggregation (Schritt 9) und die Verarbeitung der ersten Passage (Schritt 11). Es wurde berichtet, dass primitive Endoderm-abgel.......

Materialien

Reagenzien

TS-Medium:
RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM Natriumpyruvat, 100 mM beta-Mercaptoethanol und 100 mg / ml Penicillin-Streptomycin.

Mitomycin C:
Lösen Sie 2 mg Mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS und stell 'das 2 ml Mischung in 200 ml TS-Medium (10 ng / ml). Machen Sie 20 Portionen (10 ml) und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Fügen Sie ein Aliquot pro 100 mm-Platte.

Maus embryonale Fibroblasten-Zustand Medium (MEF-CM):
Platte MEFs in 100 mm-Platten (1 x 10 ⁶ / Platte). Am nächsten Tag, 10 ml TS Medium pro Schale und weiterhin Kultur für 48 Stunden. Sammeln Sie das Kulturmedium, filtern (0,45 mm) und bei -20 ° C in 35 ml Aliquots. Thaw jedes Aliquot, wenn nötig, die bei 4 gespeichert werden können ° C. Die MEFs kann für zwei weitere Chargen von CM vorbereiten, bevor sie konfluent geworden sein.

PBS / BSA:
Lösen BSA, Fraktion V (Sigma A3311, 0,1% (w / v)) in PBS (10 ml), filtriert durch ein 0,45 mm Spritzenfilter und machen 1 ml Aliquots in 1,5 ml Röhrchen. Lagerung bei -70 ° C und Auftauen einer Röhre, wenn benötigt, um FGF4 vorzubereiten.

FGF4 (1000x):
Resuspendieren lyophilisiert FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) mit 1 ml der PBS / BSA-Lösung. Gut mischen und machen 10 Aliquots (100 ml) in 1,5 ml Röhrchen und lagern bei -70 ° C. Thaw jedes Röhrchen bei Bedarf und speichern Sie die restlichen bei 4 ° C, nicht wieder einfrieren. Verdünnen 1000 mal in TS-Medium auf 1x FGF4 (25 ng / ml) zu erhalten.

Heparin (1000x):
Resuspendieren Heparin (Sigma H3149, 10.000 Einheiten) in PBS bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml (1000x). Machen Sie 100 ml Aliquots in 1,5 ml Röhrchen und lagern bei -70 ° C. Thaw Aliquots bei Bedarf und speichern Sie die restlichen bei 4 ° C, nicht wieder einfrieren. Verdünnen 1000 mal in TS-Medium auf 1x Heparin (1 ng / ml) zu erhalten.