Derivación de células madre de ratón a partir de blastocistos Trofoblasto

Summary

En este vídeo, se demuestra el aislamiento de los blastocistos de ratón y la derivación de células madre del trofoblasto de los blastocistos. También describe las condiciones para el mantenimiento de la propiedad de células madre, así como la inducción de diferenciación en la cultura.

Abstract

Especificación de la trophectoderm es uno de los eventos tempranos de diferenciación de desarrollo de los mamíferos. El linaje trofoblasto derivado de la implantación trophectoderm media y genera la parte fetal de la placenta. Como resultado, el desarrollo de este linaje es esencial para la supervivencia de los embriones. Derivación de trofoblasto del tallo (TS) las células de los blastocistos de ratón fue descrito por primera vez por Tanaka<em> Et al.</em> 1998. La capacidad de las células TS para preservar la propiedad del trofoblasto específicas y su expresión de tipos específicos de etapa y marcadores de células después de la estimulación adecuada proporciona un sistema modelo valioso para investigar el desarrollo del trofoblasto linaje por el que recapitula los primeros eventos placentación. Además, las células del trofoblasto son uno de los pocos tipos de células somáticas sometidos a la amplificación del genoma natural. A pesar de las vías moleculares que subyacen a poliploidización trofoblasto han empezado a desentrañar el papel fisiológico y las ventajas de la amplificación del genoma trofoblasto permanece en gran parte difícil de alcanzar. El desarrollo de las células madre en células diploides trofoblasto poliploides en la cultura hace que este<em> Ex vivo</em> El sistema una excelente herramienta para dilucidar el mecanismo de regulación de la replicación del genoma y la inestabilidad en la salud y la enfermedad. A continuación se describe un protocolo basado en informes anteriores, con la modificación publicada en Chiu<em> Et al.</em> 2008.

Protocol

En este protocolo, se describe la preparación de los blastocistos de ratón y el establecimiento de líneas de células TS. Manipulaciones generales del ratón antes de la recolección de los blastocistos, incluyendo la puesta a punto para el apareamiento natural y la inducción de la superovulación, básicamente, seguir el protocolo estándar ilustrado por Nagy et al. 2003 (pp146-150). Derivación y el mantenimiento de las células TS Configuración de cruzamiento entr…

Discussion

En este vídeo, que muestran el proceso para recoger E3.5 blastocistos de los procedimientos de útero y experimentales para establecer las líneas de células TS. También describe la condición de mantener la troncalidad de las células TS y para inducir su diferenciación en células diferenciadas. Dos pasos críticos para obtener líneas puras de células TS son el momento para la desagregación consecuencia (paso 9) y el procesamiento del primer paso (paso 11). Se ha informado de que la primitiva endodermo derivado…

Materials

Reagents

TS medium:
RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercaptoethanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C:
Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM):
Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 10⁶/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA:
Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x):
Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x):
Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).