In vivo de imagens de parasitas Leishmania transgênicas em um host ao vivo
Summary
Um<em> In vivo</em> Sistema de imagem é usado para gerar medições quantitativas de infecção murina com o protozoário tripanossomatídeos<em> Leishmania</em>. Este é um método não-invasivo e não-letais para a detecção de parasitas expressar luciferase dentro de muitos tecidos ao longo da crônica<em> Leishmania</em> Spp. infecção.
Abstract
Espécies distintas de<em> Leishmania,</em> Parasita um protozoário da família<em> Trypanosomatidae</em>, Normalmente causam diferentes manifestações da doença humana. As formas mais comuns da doença são a leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT). Modelos de mouse da leishmaniose são amplamente utilizados, mas a quantificação dos encargos parasita durante a doença requer murino ratos para ser sacrificado em vários momentos após a infecção. Cargas do parasita são, então, medido quer através de microscopia, limitando ensaio de diluição, ou amplificação de DNA do parasito qPCR. O<em> In vivo</em> Imagem do sistema (IVIS) tem um pacote de software integrado que permite a detecção de um sinal bioluminescente associado com as células de organismos vivos. Tanto para minimizar o uso de animais e de seguir longitudinalmente infecção em indivíduos, em modelos in vivo para imagens<em> Leishmania</em> Spp. VL causando ou CL foram estabelecidas. Parasitas foram projetadas para expressar luciferase, e estes foram introduzidas em ratos ou por via intradérmica ou por via intravenosa. Medições quantitativas da bioluminescência condução luciferase dos transgênicos<em> Leishmania</em> Parasitas dentro do rato foram feitas usando IVIS. Camundongos individuais podem ser fotografada várias vezes durante estudos longitudinais, permitindo-nos avaliar a variação inter-animal na inóculos parasita inicial experimental, e avaliar a multiplicação dos parasitas em tecidos de camundongos. Parasitas sejam detectados com alta sensibilidade em locais cutâneas. Embora seja muito provável que o sinal (fótons / segundo / parasita) é mais baixa em mais órgãos viscerais que a pele, mas as comparações quantitativas de sinais em superficial contra sites de profunda não ter sido feito. É possível que os números do parasita entre os sites corpo não podem ser diretamente comparados, apesar de cargas do parasita nos mesmos tecidos podem ser comparados entre ratos. Exemplos de uma espécie visceralizing (<em> L. infantum chagasi</em>) E uma espécie causando a leishmaniose cutânea (<em> L. mexicana</em>) São mostradas. O procedimento IVIS pode ser usado para monitoramento e análise de modelos animais de pequeno porte de uma grande variedade de<em> Leishmania</em> Espécies que causam as diferentes formas de leishmaniose humana.
Protocol
Discussion
O sistema de imagem in vivo (IVIS) fornece um método para geração de imagens animal inteiro ou in vivo de imagens modelos de infecção experimental de diferentes formas de leishmaniose. 18,16 A spp Leishmania. parasitas podem ser projetados para expressar luciferase firefly a um nível que é detectado in vivo com a tecnologia de imagem IVIS. Uma das grandes vantagens deste método é que permite visualização não invasiva de Leishmania spp. dentro do animal …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte por uma concessão comentário Mérito do Department of Veterans Affairs, pelo NIH concede AI045540, AI067874, AI076233-01 e AI080801 (MEW), e por AI29646 (SMB). O trabalho foi realizado em parte durante o financiamento de CT e JG pelo NIH T32 AI07511.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| D-Luciferin Potassium Salt | Reagent | Caliper LifeSciences (Formerly Xenogen) | 122796 | |
| IVIS Imaging System 200 Series | Equipment | Caliper LifeSciences | Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum. |
References
- Capul, A. A., Barron, T., Dobson, D. E., Turco, S. J., Beverley, S. M. Two functionally divergent UDP-Gal nucleotide sugar transporters participate in phosphoglycan synthesis in Leishmania major. J Biol Chem. 282, 14006-14017 (2007).
- LeBowitz, J. H., Coburn, C. M., McMahon-Pratt, D., Beverley, S. M. Development of a stable Leishmania expression vector and application to the study of parasite surface antigen genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9736-9740 (1990).
- Mureev, S., Kushnir, S., Kolesnikov, A. A., Breitling, R., Alexandrov, K. Construction and analysis of Leishmania tarentolae transgenic strains free of selection markers. Mol Biochem Parasitol. 155, 71-83 (2007).
- Chakkalath, H. R. Priming of a beta-galactosidase (beta-GAL)-specific type 1 response in BALB/c mice infected with beta-GAL-transfected Leishmania major. Infect Immun. 68, 809-814 (2000).
- Sacks, D. L., Perkins, P. V. Identification of an infective stage of Leishmania promastigotes. Science. 223, 1417-1419 (1984).
- da Silva, R., Sacks, D. L. Metacyclogenesis is a major determinant of Leishmania promastigote virulence and attenuation. Infect Immun. 55, 2802-2806 (1987).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99, 97-103 (2001).
- Scott, P., Caspar, P., Sher, A. Protection against Leishmania major in BALB/c mice by adoptive transfer of a T cell clone recognizing a low molecular weight antigen released by promastigotes. J Immunol. 144, 1075-1079 (1990).
- Belkaid, Y. The role of interleukin (IL)-10 in the persistence of Leishmania major in the skin after healing and the therapeutic potential of anti-IL-10 receptor antibody for sterile cure. J Exp Med. 194, 1497-1506 (2001).
- Wilson, M. E. Local suppression of IFN-gamma in hepatic granulomas correlates with tissue-specific replication of Leishmania chagasi. J Immunol. 156, 2231-2239 (1996).
- McElrath, M. J., Murray, H. W., Cohn, Z. A. The dynamics of granuloma formation in experimental visceral leishmaniasis. J Exp Med. 167, 1927-1937 (1988).
- Ato, M. Loss of dendritic cell migration and impaired resistance to Leishmania donovani infection in mice deficient in CCL19 and CCL21. J Immunol. 176, 5486-5493 (2006).
- Ahmed, S. Intradermal infection model for pathogenesis and vaccine studies of murine visceral leishmaniasis. Infect Immun. 71, 401-410 (2003).
- Kamala, T. Hock immunization: a humane alternative to mouse footpad injections. J Immunol Methods. 328, 204-214 (2007).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cell Microbiol. 7, 383-392 (2005).
- Brittingham, A., Miller, M. A., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Regulation of GP63 mRNA stability in promastigotes of virulent and attenuated Leishmania chagasi. Mol Biochem Parasitol. 112, 51-59 (2001).
- Roy, G. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Mol Biochem Parasitol. 110, 195-206 (2000).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Hardy, J., Margolis, J. J., Contag, C. H. Induced Biliary Excretion of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 74, 1819-1827 (2006).
- Lecoeur, H. Optimization of Topical Therapy for Leishmania major Localized Cutaneous Leishmaniasis Using a Reliable C57BL/6 Model. PLoS Negl Trop Dis. 1, e34-e34 (2007).
- Lang, T., Lecoeur, H., Prina, E. Imaging Leishmania development in their host cells. Trends Parasitol. 25, 464-473 (2009).
