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Eficacia de la punción subcutánea de Fu en el dolor del nervio ciático: cambios conductuales y electrofisiológicos en un modelo de rata con lesión por constricción crónica

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65406
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 5,6, 7,8,9
1Department of Chinese Medicine, Chang Bing Show Chwan Memorial Hospital, 2Graduate Institute of Integrated Medicine, College of Chinese Medicine, China Medical University, 3Institute of Fu's Subcutaneous Needling, Beijing University of Chinese Medicine, 4Clinical Medical College of Acupuncture & Moxibustion and Rehabilitation, Guangzhou University of Chinese Medicine, 5Experimental Animal Center, Department of Molecular Biology and Cell Research, Chang Bing Show Chwan Memorial Hospital, 6Department of Pharmacy and Master Program, Tajen University, 7Department of Physical Medicine and Rehabilitation, China Medical University Hospital, 8Department of Physical Therapy and Graduate Institute of Rehabilitation Science, China Medical University, 9Department of Physical Medicine and Rehabilitation, Asia University Hospital, Asia University
* These authors contributed equally

Summary

Presentamos un protocolo para el uso de la punción subcutánea de Fu en un modelo de lesión por constricción crónica para inducir dolor del nervio ciático en ratas.

Abstract

La punción subcutánea (FSN) de Fu, una técnica de acupuntura inventada de la medicina tradicional china, se utiliza en todo el mundo para aliviar el dolor. Sin embargo, los mecanismos de acción aún no se comprenden completamente. Durante el tratamiento con FSN, la aguja FSN se inserta y se retiene en los tejidos subcutáneos durante un largo período de tiempo con un movimiento de balanceo. Sin embargo, los investigadores plantean desafíos al mantener una postura mientras se manipula la FSN en modelos animales (por ejemplo, ratas). Un tratamiento incómodo puede provocar miedo y resistencia a las agujas FSN, lo que aumenta el riesgo de lesiones e incluso puede afectar a los datos de la investigación. La anestesia también puede afectar los resultados del estudio. Por lo tanto, existe la necesidad de estrategias en la terapia de FSN en animales que minimicen las lesiones durante la intervención. Este estudio emplea un modelo de lesión por constricción crónica en ratas Sprague-Dawley para inducir dolor neuropático. Este modelo replica el dolor inducido por la lesión nerviosa observada en humanos a través de la constricción quirúrgica de un nervio periférico, imitando la compresión o atrapamiento que se observa en afecciones como los síndromes de compresión nerviosa y las neuropatías periféricas. Introducimos una manipulación apropiada para insertar fácilmente una aguja FSN en la capa subcutánea del cuerpo del animal, incluida la inserción y dirección de la aguja, la retención de la aguja y el movimiento de balanceo. Minimizar la incomodidad de la rata evita que la rata esté tensa, lo que hace que el músculo se contraiga y dificulte la entrada de la aguja y mejora la eficiencia del estudio.

Introduction

Se estima que el dolor neuropático, definido como el dolor causado por daño nervioso, afecta al 6,9%-10% de la población mundial, y la prevalencia a lo largo de la vida es del 49%-70%1,2. También se considera uno de los síndromes de dolor más difíciles de manejar. El uso de agentes farmacológicos para el manejo del dolor neuropático ha tenido un éxito limitado, ya que los analgésicos comúnmente prescritos, como los antiinflamatorios no esteroideos y los opioides, han mostrado poca eficacia para aliviar este tipo de dolor 3,4. Por lo tanto, existe una gran necesidad de explorar nuevas opciones de tratamiento, especialmente tratamientos no farmacológicos. La acupuntura, como intervención no farmacológica, puede aliviar el dolor neuropático al ejercer efectos analgésicos sobre el sistema somatosensorial. Tanto los estudios clínicos como los preclínicos han indicado que la acupuntura es eficaz para aliviar los síntomas del dolor neuropático sin efectos secundarios significativos 5,6,7. Sin embargo, el mecanismo central del tratamiento con acupuntura para el alivio del dolor en el dolor neuropático aún no se ha investigado más a fondo.

En los últimos años, la punción subcutánea de Fu (FSN) ha ganado popularidad para el tratamiento de trastornos neurológicos relacionados con eldolor. La NSF se originó a partir de la acupuntura tradicional china y fue descrita por primera vez por el médico tradicional chino Zhonghua Fu en 1996 9,10. Si bien se originó en la acupuntura tradicional, la FSN difiere significativamente en sus técnicas y teorías de la acupuntura basada en meridianos, los principios del yin y el yang y los conceptos de puntos de acupuntura. La FSN pone mayor énfasis en los abordajes neurofisiológicos y anatómicos para abordar eficazmente el dolor miofascial11. La terapia FSN se aplica en la práctica clínica para abordar diversos trastornos musculares dolorosos, dirigiéndose a los tejidos conectivos estrechamente asociados con los músculos, centrándose especialmente en el tratamiento de los músculos tensos (MT)12. Como terapia complementaria para el alivio del dolor, también existe evidencia clínica de que la FSN es efectiva en el tratamiento de lesiones de tejidos blandos, además de proporcionar un rápido manejo del dolor y una mejoría significativa en los espasmos de los tejidos blandos13,14. La terapia con FSN implica técnicas específicas diseñadas para abordar los puntos gatillo miofasciales (MTrP) subyacentes asociados con la afección. La posición de inserción de la aguja FSN se elige cuidadosamente en función de la ubicación de estos puntos gatillo, lo que permite apuntar con precisión a las áreas afectadas. Durante el procedimiento, la aguja FSN se inserta en la capa subcutánea, donde se detiene intencionalmente para optimizar los efectos terapéuticos. A continuación, se emplea una técnica distintiva conocida como movimiento de balanceo, que implica un suave movimiento oscilante de la aguja para estimular los tejidos y promover las respuestas terapéuticas10. El desarrollo de MTrP se asocia con la teoría de la crisis energética, que explica que factores como la sobrecarga muscular crónica, el ejercicio excesivo, las posturas de esfuerzo inadecuadas, la atrofia muscular y la degeneración pueden contribuir a la aparición de isquemia e hipoxia del tejido muscular. Se cree que esta deficiencia de oxígeno y energía dentro del tejido muscular juega un papel clave en la formación de MTrPs15,16. Estudios previos en animales han encontrado que el tratamiento con FSN para el dolor crónico en ratas mejora la estructura morfológica y la función de las mitocondrias en las MT hasta cierto punto, validando el potencial de la terapia con FSN para promover la recuperación de los nervios y músculos dañados17.

La ciática ha sido clasificada como dolor neuropático18. Se cree que el origen del dolor neuropático se encuentra en cualquier lugar entre la placa terminal motora y la capa fibrosa externa del músculo, involucrando el sistema microvascular y los neurotransmisores a nivel celular. La pérdida de inervación muscular y la apoptosis de las células nerviosas inervadas se produce cuando se produce un daño nervioso19, lo que lleva a una marcha relacionada con el dolor en la extremidad afectada. Además, la compresión crónica o la irritación del nervio pueden conducir a una variedad de cambios en la forma de las funciones nerviosas, lo que puede exacerbar aún más los síntomas de la ciática. Sin embargo, la complejidad del sistema nervioso dificulta su replicación in vitro, por lo que es necesario el uso de modelos animales para este tipo de estudios. En la investigación de los trastornos de dolor neuropático, los organismos modelo se emplean comúnmente, involucrando varios métodos de lesión directa de los nervios periféricos, como la ligadura del nervio ciático, la transección o la compresión21,22. El modelo de lesión por constricción crónica (CCI) en ratas Sprague-Dawley se ha utilizado para inducir dolor neuropático. Este modelo replica el dolor inducido por la lesión nerviosa observada en humanos a través de la constricción quirúrgica de un nervio periférico, imitando la compresión o atrapamiento que se observa en afecciones como los síndromes de compresión nerviosa y las neuropatías periféricas.

En este estudio, evaluamos los efectos analgésicos de la terapia con FSN y la electroterapia de baja frecuencia (estimulador nervioso eléctrico transcutáneo, TENS) en ratas con lesión crónica por constricción y dolor neuropático. Como la anestesia ralentiza o bloquea los impulsos nerviosos y afecta la transmisión sináptica y la función neuronal23, los animales no pueden ser anestesiados bajo todos los procedimientos de punción y movimientos de balanceo. Por lo tanto, se requiere una técnica de aguja adecuada para reducir las molestias en ratas. Se describen en detalle los pasos para establecer un modelo de CCI en ratas, la forma en que las ratas fueron tratadas con FSN combinando el movimiento de balanceo sin anestesia, las pruebas factibles de patrones de comportamiento animal y las investigaciones electrofisiológicas.

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Protocol

Todos los procedimientos que involucran a sujetos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Chang Bing Show Chwan Memorial Hospital, Changhua, Taiwán (111031) en octubre de 2022 (Figura 1).

1. Preparación de los animales

  1. Compre 48 ratas macho Sprague-Dawley (SD) (edad: 8-10 semanas, peso: 250-300 g).
  2. Las ratas domésticas se alojan individualmente en jaulas ventiladas a 24 ± 2 °C y un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas.
  3. Alimente a las ratas con una dieta estándar de gránulos con agua potable estéril lista para usar y proporcione ropa de cama suave.

2. Agrupación de animales

  1. Dividir aleatoriamente 48 ratas SD en seis grupos (n = 8 por grupo): el grupo simulado, el grupo CCI, el grupo CCI+FSN, el grupo CCI+TENS, el grupo FSN solo y el grupo TENS solo, como en el estudio anterior realizado por Chan et al.24.
    NOTA: Los detalles de seis grupos: (1) Grupo simulado: sin cirugía ni tratamiento; (2) Grupo CCI: preparado para cirugía sin tratamiento; (3) Grupo de tratamiento CCI+FSN: tratamiento FSN después de un modelado exitoso de CCI; (4) Grupo de tratamiento CCI+TENS: tratamiento TENS después de un modelado exitoso de CCI; (5) Grupo de tratamiento solo con FSN: solo tratamiento con FSN sin cirugía; (6) Grupo de tratamiento con TENS solo: solo tratamiento con TENS sin cirugía.

3. Establecimiento de un modelo de rata CCI

NOTA: El modelo de cirugía CCI en ratas fue modificado de acuerdo con Bennett y Xie realizado en 198825.

  1. Asegúrese de que el operador use una mascarilla quirúrgica, un gorro de operación desechable y guantes estériles.
  2. Desinfectar la superficie de la mesa quirúrgica con etanol al 70%. Esterilice los instrumentos (p. ej., tijeras, fórceps y retractores), gasas, grapas e hisopos de algodón mediante autoclave.
    NOTA: Se utilizan técnicas asépticas durante todo el procedimiento quirúrgico.
  3. Anestesiar a las ratas con isoflurano al 4% después de la preparación estándar de la piel (afeitado) y mantener con isoflurano al 2% (Figura 2A).
    1. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia observando la falta de respuesta después de pellizcar la pata trasera y monitoreando a las ratas anestesiadas durante todo el procedimiento.
    2. Aplique suficiente ungüento oftálmico veterinario sobre los ojos para protegerlos contra la sequedad.
  4. Coloque a la rata en posición prona en la mesa de operaciones y afeite el pelo del costado de la pata trasera derecha, luego desinfecte la piel con una solución de povidona yodada y etanol al 75% tres veces. Proporcione soporte térmico durante todo el procedimiento y use paños estériles para cubrir el sitio quirúrgico.
    1. Hacer una incisión paralela en la piel 3-4 mm por debajo del fémur de unos 20-50 mm.
    2. Priorizar la identificación de las posiciones del glúteo mayor y bíceps femoral. Separe la grasa subcutánea y la fascia superficial capa por capa con unas tijeras quirúrgicas, cortando el tejido conectivo circundante para exponer el músculo (Figura 2B).
      NOTA: Para distinguir la grasa subcutánea y las capas superficiales de la fascia, observe la textura y el color. La capa de grasa subcutánea debe aparecer suave y flexible con un aspecto amarillento o blanquecino. La fascia superficial es una fina capa fibrosa situada directamente debajo de la grasa subcutánea. Diferencie entre las capas palpando suavemente o sondeando con un instrumento contundente, teniendo en cuenta que la grasa subcutánea ofrece más resistencia a la presión en comparación con la fascia superficial.
  5. Con unas tijeras sin filo, corte el tejido conectivo entre los músculos glúteo superficial y bíceps femoral.
    1. Amplíe el espacio entre estos dos músculos usando un retractor para exponer el nervio ciático (Figura 2C).
      NOTA: Para identificar visualmente el nervio ciático en una rata, concéntrese en la región del muslo. Localiza el punto medio de la región del muslo para visualizar el nervio ciático. Por lo general, el nervio corre a lo largo de la cara posterior del muslo, comenzando desde la región de la cadera y extendiéndose hacia la rodilla.
    2. Sin alterar la morfología del nervio, recoja el nervio ciático con una microaguja a través de una buena fuente de luz. Ligar el nervio ciático dos veces usando ligaduras tripas crómicas 3-0, colocando los puntos de ligadura aproximadamente a 1 mm de distancia entre las dos suturas.
    3. Comenzando con un lazo suelto para cada ligadura, agarre los extremos de la ligadura cerca del lazo y apriete hasta que el lazo quede ajustado, asegurándose de que la ligadura no se deslice a lo largo del nervio. Deténgase cuando se observe un ligero espasmo de la extremidad durante la ligadura (Figura 2D).
  6. Cierre el músculo y la piel capa por capa con líneas de sutura 4-0. Por último, desinfectar la herida con yodo (Figura 2E).
  7. Vigile de cerca los signos vitales de las ratas durante la anestesia y colóquelas en jaulas de recuperación individuales hasta que estén despiertas antes de volver a colocarlas en sus jaulas. Forre las jaulas con ropa de cama de papel plano para evitar la asfixia en animales inconscientes. Una breve contracción en la extremidad postoperatoria indica una operación exitosa (Figura 2F).
  8. Realice pruebas de hipersensibilidad al dolor varias veces antes de la ICC (línea de base) y en diferentes momentos después de la ICC.
  9. Observe el dolor espontáneo y los cambios de comportamiento en los días 1, 3, 5 y 7 después de la construcción del modelo.
    NOTA: Observe la marcha y la postura de la extremidad trasera derecha y la presencia de lamidos y mordeduras en la extremidad.
    1. Identificar la presencia de dolor neuropático para determinar el establecimiento exitoso del modelo y excluir ratas no exitosas.
      NOTA: Evalúe el éxito del modelo observando signos como debilidad al caminar de las extremidades inferiores, dedos de la extremidad derecha unidos con valgo leve, colgando con frecuencia y renuencia a aterrizar. Observa a la rata de pie con la extremidad trasera izquierda soportando el peso, mientras que la extremidad trasera derecha está levantada y cerca del abdomen.

4. Administración de la manipulación de FSN

  1. Fije la rata del grupo de tratamiento con FSN (incluido el grupo CCI+FSN y FSN solo) en el sistema de sujeción para roedores con la extremidad afectada expuesta lateralmente. Proporcionar soporte térmico durante todo el procedimiento. Ambos grupos fueron tratados con agujas desechables FSN (Figura 3A).
  2. Sin anestesia, extienda las extremidades traseras de la rata de forma gradual y lenta hasta que estén tensas (Figura 3B).
    NOTA: La cabeza de la rata está cubierta con un paño quirúrgico para mantener al animal tranquilo y estable. No extienda demasiado la pata para causar lesiones a la rata. Observa de cerca la respuesta de la rata para detectar cualquier signo de angustia o incomodidad. Si la rata muestra signos de dolor o malestar, detenga la extensión y proporcione un descanso antes de volver a intentarlo.
  3. Retire la funda protectora de la aguja FSN.
    1. Inserte la punta de la aguja FSN hacia los MT (músculos con MTrP), aproximadamente cerca del músculo glúteo mayor, ubicado en la parte baja de la espalda y en la parte posterior.
  4. Coloque la aguja FSN plana e introduzca la piel en un ángulo de aproximadamente 15°.
    1. Empújelo con cuidado y rapidez a través de la piel y hacia el espacio subcutáneo para evitar el estrés en la rata hasta que se inserte por completo. Asegúrese de que la aguja esté lo suficientemente insertada como para enterrar completamente el tubo blando debajo de la piel.
    2. Al empujar hacia adelante, levante ligeramente la punta de la aguja para observar si la protuberancia de la piel se mueve a lo largo de la punta de la aguja (Figura 3C).
  5. Realice el movimiento de balanceo abanicando suave y suavemente la punta de la aguja FSN con el pulgar como punto de apoyo mientras mantiene el dedo índice, el dedo medio y el anular alineados en línea recta.
    1. Sostenga la aguja FSN entre el dedo medio y el pulgar en posición cara a cara, y alterne el movimiento hacia adelante y hacia atrás con los dedos índice y anular.
    2. Ajuste la frecuencia a 100 golpes por minuto y realice la operación durante aproximadamente 1 minuto (Figura 3D).
  6. Después de completar la manipulación, retire rápidamente la aguja FSN.
    NOTA: La operación se realizó cada 2 días durante un total de cuatro sesiones (días 1, 3, 5 y 7 después de la creación del modelo CCI). Las agujas desechables FSN deben usarse una vez. El uso repetido desafilará la aguja y causará un mayor dolor en ratas.

5. Administración de la manipulación de TENS

  1. Fije la rata del grupo de tratamiento TENS (incluido el grupo CCI+TENS y TENS solo) en el sistema de retención de roedores con la extremidad afectada expuesta lateralmente. Proporcionar soporte térmico durante todo el procedimiento. Asegúrese de que el pelaje esté afeitado antes de ser tratado.
    NOTA: Los electrodos se cortaron a 45 mm (largo) por 5 mm (ancho) (Figura 4A).
  2. Elija el punto Zusanli (ST36) y el punto Sanyinjiao (SP6) como ubicaciones para TENS. Esto se basa en la teoría para el tratamiento del dolor neuropático26,27.
    1. Localice el punto Zusanli (ST36) aproximadamente 5 mm lateral al tubérculo anterior de la tibia, entre la tibia y el peroné, justo debajo de la rodilla28.
    2. Localice el punto de Sanyinjiao (SP6) en el borde posterior de la tibia, 3 mm proximal al maléolo medial28.
      NOTA: Ambos puntos de acupuntura se localizan mediante inspección manual como se describe en Stux y Pomeranz y en el atlas de acupuntura animal28,29 (Figura 4B).
  3. Administre una estimulación eléctrica de baja frecuencia (onda sinusoidal continua de 2 Hz, 3 mA) durante 10 minutos utilizando el dispositivo TENS con el electrodo aplicado en la pierna alrededor del nervio. Cubre la cabeza de la cabeza de la rata con un paño quirúrgico para mantenerla tranquila y estable.
    NOTA: Este procedimiento se realiza cada 2 días durante un total de cuatro sesiones (días 1, 3, 5 y 7 después de crear el modelo CCI).

6. Mediciones fisiológicas realizando la prueba de comportamiento animal

NOTA: El índice de función ciática (SFI)30 es un índice ampliamente utilizado por los investigadores que estudian la patología y el tratamiento potencial de las lesiones nerviosas, determinado comparando la geometría de la pata trasera afectada en ratas lesionadas con la de la pata contralateral y comparándola con la pata opuesta.

  1. Diseñe pasarelas para ratas con plexiglás transparente y espejos inclinables para capturar las huellas y la orientación del cuerpo de las ratas durante la caminata.
    NOTA: La pasarela es una plataforma de 10 cm de largo, 50 cm de ancho y 15 cm de alto con un forro de papel blanco en la parte inferior (Figura 5A).
  2. Coloque suave y libremente a las ratas en la caja y deje que se aclimaten a su nuevo entorno durante al menos 5 minutos antes de grabar.
    NOTA: Se tiene especial cuidado en minimizar el estrés innecesario en el animal para evitar su posible efecto sobre la tensión muscular postural.
  3. Sumerge las patas de la rata en tinta roja y deja que la rata camine a lo largo de la franja de la pasarela, dejando rastros en el papel de respaldo. Registre al menos 2 s de caminata continua para cada prueba. Haga que la rata camine al menos 3 veces en una dirección (Figura 5B).
    NOTA: Aplique tinta roja de secado rápido, no tóxica y soluble en agua a ambas patas traseras para que las huellas traseras sean claramente visibles.
  4. Al final del experimento, seque las tiras de la pasarela para medir los parámetros. Mide sus huellas con una regla y redondea a 0,5 mm más cercanos.
    NOTA: Se seleccionaron tres huellas claras de cada rata de varias huellas y se midieron tres parámetros diferentes. Los factores para SFI incluyen la longitud de impresión (PL), la extensión de la puntera (TS) y la extensión intermedia de la puntera (ITS).
    Los valores de SFI se calculan utilizando la siguiente fórmula31:
    Equation 1
    (EPL, longitud de impresión experimental; NPL, longitud normal de impresión; ETS, extensión experimental de los dedos de los pies; NTS: extensión normal de los dedos de los pies; EIT: extensión intermedia experimental de los dedos; NIT: extensión intermedia de los dedos).
    SFI = 0 y - 100 indica una disfunción normal y completa. A las ratas que arrastraban los dedos de los pies se les asignó arbitrariamente un valor de -100. Para una función neurológica normal, el SFI oscila alrededor de 0, mientras que alrededor de -100 SFI representa una disfunción completa32.

7. Evaluación neurofisiológica por medición electrofisiológica33

NOTA: Se utilizó electromiografía para registrar la actividad electrofisiológica en este estudio. El potencial de acción muscular compuesto (CMAP) es causado por la activación de las fibras musculares en el músculo objetivo irrigado por el nervio. Se investigan la amplitud y la latencia de CMAP. La amplitud del CMAP se mide desde el inicio hasta el pico negativo. La latencia de los CMAP se determina midiendo el tiempo entre la aplicación del estímulo y el inicio del potencial de acción compuesto, que está influenciado por la distancia entre el sitio de estimulación y el sitio de registro. La electrofisiología proporciona una evaluación objetiva de la función de los nervios periféricos en ratas.

  1. Administrar Zoletil 50 (40 mg/kg, ip) para anestesiar a las ratas. Preparar la piel según los protocolos estándar (afeitado).
  2. Coloque electrodos adhesivos desechables para superficies (20 mm de diámetro exterior) en las áreas designadas. Fijar los electrodos de registro a las superficies lateral y dorsal del músculo gastrocnemio (Figura 6A).
  3. Aplicar estimulación eléctrica (intensidad 1,2 mA) en el vástago del nervio ciático proximal derecho. Registre un potencial de acción muscular compuesto (CMAP) en el vientre del músculo gastrocnemio (Figura 6B).
    NOTA: Tenga cuidado al insertar los electrodos para evitar el tejido muscular.
  4. Registre el efecto de tres mediciones repetidas para cada rata.
    NOTA: El CMAP se expresa como la media ± DE de cada grupo. La señal fue amplificada por un amplificador, filtrado (0,3-3 kHz). Después de la integración (constante de tiempo = 0,05 s), se introducen tanto la señal original como la señal integrada. A continuación, la señal original y la señal integrada se digitalizan en el sistema PowerLab y se almacenan en el disco duro del ordenador.
  5. Después de completar los procedimientos de electrofisiología, mueva a la rata a una jaula diferente y vigílela hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener una posición reclinada esternal. Una vez que la rata se haya recuperado por completo de la anestesia, transfiérela de nuevo a su jaula original.

8. Estadísticas:

  1. Evalúe las diferencias en SFI y CMAP entre los grupos utilizando el análisis de varianza de medidas repetidas (ANOVA).
  2. Cuantificar los datos por parte de asistentes que son ciegos a las condiciones experimentales. Exprese los datos como media ± desviación estándar.
  3. Compare los datos, cuando corresponda, utilizando la prueba t de dos colas emparejadas y no apareadas de Student. Establecer significación estadística como p < 0,05.

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Representative Results

Huellas y determinación del SFI
Examinamos el desarrollo de SFI en los grupos CCI solo, CCI+FSN y CCI+TENS (Figura 7). Después de 4 sesiones de tratamientos con FSN y TENS en el día 7 para la cirugía de CCI, el SFI en los grupos CCI+FSN (-15,85 ± 3,46) y CCI+TENS (-29,58 ± 9,19) mejoró significativamente en comparación con el grupo de CCI solo (-87,40 ± 14,22). La mejoría fue significativa en el grupo CCI+FSN en comparación con el grupo CCI+TENS (Figura 7A).

También se investigó el SFI en los grupos simulados (0,02 ± 0,52), solo FSN (0,06 ± 1,75) y TENS solo (-2,36 ± 1,22). Los resultados mostraron que ninguno de estos dos últimos grupos y el grupo simulado tuvieron diferencias significativas entre sí (Figura 7B). Esto indica que FSN y TENS son tratamientos seguros que no causan ningún daño a las ratas en su estado saludable (Tabla 1).

Respuesta electrofisiológica
Examinamos el desarrollo de la amplitud de CMAP en los grupos de tratamiento CCI solo, CCI+FSN y CCI+TENS (Figura 8). La amplitud de CMAP en los grupos CCI+FSN (5,01 mV ± 0,67 mV) y CCI+TENS (4,64 mV ± 1,96 mV) mejoró significativamente en comparación con el grupo CCI solo (1,80 mV ± 0,34 mV) (Tabla 2). Los grupos CCI+FSN y CCI+TENS no mostraron diferencias significativas (Figura 8A).

También examinamos el desarrollo de los picos de latencia de CMAP en los grupos CCI solo, CCI+FSN y CCI+TENS. Los picos de latencia de CMAP en los grupos CCI+FSN (2,46 ms ± 0,72 ms) y CCI+TENS (2,26 ms ± 0,97 ms) mejoraron significativamente en comparación con el grupo CCI solo (1,23 ms ± 0,22 ms) (Tabla 3). Los grupos CCI+FSN y CCI+TENS no mostraron diferencias significativas (Figura 8C).

Se investigó la amplitud y latencia de CMAP en los grupos simulados (5,80 mV ±0,53 mV; 2,35 ms ± 0,37 ms), FSN solo (5,70 mV ± 0,45 mV; 2,64 ms ± 0,41 ms) y TENS solo (5,54 mV ± 0,92 mV; 2,61 ms ± 0,20 ms), no se observaron diferencias significativas entre ninguno de ellos. Esto indica que tanto la FSN como la TENS son tratamientos seguros y no causan daño a las ratas en su estado saludable (Figura 8B, D).

Figure 1
Figura 1: Vista esquemática de la línea de tiempo para establecer el modelo de rata CCI. Los umbrales de dolor se miden desde el primer día después del modelado (-7 días) y luego cada 2 días a partir de entonces (-5, -3, -1 días). Los umbrales de dolor medidos en el día 1 indican un modelado exitoso. Después del modelado, la intervención y las mediciones electrofisiológicas se inician el día 1. Los grupos CCI+FSN, CCI+TENS, FSN solo y TENS solo fueron tratados con FSN o TENS en puntos de tiempo fijos en los días 1, 3, 5 y 7, respectivamente. Las ratas fueron sacrificadas el día 7 después de mediciones electrofisiológicas y fisiológicas. Abreviaturas: FSN: Punción subcutánea de Fu; TENS: estimulación nerviosa eléctrica transcutánea; ICC: lesión crónica por constricción; SFI: índice de función ciática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Lesión por constricción crónica (ICC) para inducir dolor neuropático del nervio ciático en ratas. (A) Después de la colocación y desinfección, se afeita la pata trasera derecha de la rata. Se realiza una incisión paralela en la piel a 3-4 mm por encima del fémur. (B) Se ingresa al sitio con cuidado mientras se tensa el músculo, se separan las fibras musculares y luego se eliminan en capas sin cerrarlas por completo. El tejido conectivo entre los músculos glúteo superficial y bíceps femoral se incide y la fascia se separa capa por capa. (C) La incisión permanece abierta, exponiendo el nervio ciático lateral derecho. (D) La ligadura se ata alrededor del nervio ciático con una sutura de cromo 3-0, asegurando que la ligadura esté asegurada en su lugar y no se deslice a lo largo del nervio y restrinja el flujo sanguíneo a la membrana externa del nervio. (E) La capa muscular y la piel se cierran con suturas. (F) Una breve contracción en la extremidad postoperatoria (los círculos rojos indican la rama terminal del nervio ciático) indica una operación exitosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Manipulación de la punción subcutánea de Fu (FSN). (A) Fije a la rata en el sistema de sujeción de roedores con las extremidades traseras expuestas, evitando forzar (B) La aguja FSN se inserta hacia el músculo tenso, aproximadamente cerca del músculo glúteo mayor. (C) La aguja se inserta en la piel con la punta de la aguja colocada aproximadamente a 15° de la piel. (D) Movimiento de balanceo (abanico negro) de la punción subcutánea Fu. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Posición y fijación de los electrodos en la superficie de la piel de la rata para aplicar la estimulación nerviosa eléctrica transcutánea (TENS). (A) Electrodos, cortados a 45 mm (largo) por 5 mm (ancho), colocados en la rata. (B) Localización de los puntos de acupuntura ST 36 y SP6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Registro de huellas en la pasarela. (A) La pasarela para mediciones fisiológicas mediante la evaluación del índice funcional ciático (SFI). (B) Huellas registradas en el7º día postoperatorio. Las diferencias en las mediciones de varias patas de animales pueden diferenciar entre las patas de los grupos simulado, CCI, CCI+FSN, CCI+TENS, FSN solo y TENS solo. Para calcular valores como el SFI se utilizan medidas como la distancia entre el segundo dedo y el cuarto dedo del pie, la extensión de los dedos (TS, la distancia transversal entre el primer y el quinto dedo) y la longitud de la pata (PL). Abreviaturas: FSN: Punción subcutánea de Fu; TENS: estimulación nerviosa eléctrica transcutánea; ICC: lesión por constricción crónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Variación en la actividad nerviosa digital en función de la intensidad del estímulo y las mediciones distales del sitio de registro de ratas a través de la electrofisiología. (A) Mediciones electrofisiológicas para el registro de potenciales de acción muscular compuestos (CMAP). Los electrodos de registro y de referencia (parche azul) se colocan en los músculos gastrocnemio lateral y medial, respectivamente, y se aplica estimulación eléctrica en el extremo proximal del tronco del nervio ciático derecho bajo la anestesia inducida y mantenida con Zoletil. (B) Grupos representativos de rastreo de CMAPs simulados, CCI, CCI+FSN, CCI+TENS, FSN solo y TENS solos después de 4 tratamientos (antes de la eutanasia del animal). Para calcular las amplitudes del potencial de acción muscular compuesto (CMAP) de línea de base a pico (B-P) y de pico a pico (P-P), la forma de onda se mide desde la línea de base (I) hasta el pico negativo (II) y desde el pico negativo (II) hasta el pico positivo (III), respectivamente. El eje X representa el tiempo (ms) y el eje Y representa el voltaje (mV). Sensibilidad: 1 mV; Duración: 2 ms, 1 ms por fotograma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Índice funcional ciático (SFI) para cada grupo. (A) Comparación del SFI entre los grupos CCI, CCI+FSN y CCI+TENS (* p < 0,05). (B) Comparación del SFI entre los grupos simulados, FSN solo y TENS solos. Abreviaturas: FSN: Punción subcutánea de Fu; TENS: estimulación nerviosa eléctrica transcutánea; ICC: lesión crónica por constricción; SFI: índice de función ciática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Hallazgos electrofisiológicos para cada grupo. (A) Amplitud de CMAP, comparación entre los grupos CCI, CCI+FSN y CCI+TENS (* p < 0,05). (B) Amplitud de CMAP, comparación entre los grupos Sham, FSN solo y TENS solo. (C) Picos de latencia de CMAP, comparación entre los grupos CCI, CCI+FSN y CCI+TENS (* p < 0,05). (D) Picos de latencia de CMAP, comparación entre los grupos Sham, FSN solo y TENS solo. Abreviaturas: FSN: Punción subcutánea de Fu; TENS: estimulación nerviosa eléctrica transcutánea; ICC: lesión crónica por constricción; CMAP: potencial de acción muscular compuesto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

N Significar SD
Fingir 8 0.02 0.52
CCI 8 -87.40 14.22
CCI+FSN 8 -15.85 3.46
CCI+DIEZ 8 -29.58 9.19
FSN 8 0.06 1.75
DIEZ 8 -2.36 1.22
FSN: Punción subcutánea de Fu;
TENS: estimulación nerviosa eléctrica transcutánea;
ICC: lesión por constricción crónica.

Tabla 1: Resumen de los valores del índice funcional ciático en ratas.

N Media (mV) SD
Fingir 8 5.80 0.53
CCI 8 1.80 0.34
CCI+FSN 8 5.01 0.67
CCI+DIEZ 8 4.64 1.96
FSN 8 5.70 0.45
DIEZ 8 5.54 0.92
FSN: Punción subcutánea de Fu;
TENS: estimulación nerviosa eléctrica transcutánea;
ICC: lesión crónica por constricción;
CMAP: potencial de acción muscular compuesto.

Tabla 2: Resumen de los valores de la respuesta electrofisiológica sobre la amplitud de CMAP en ratas.

N Media (ms) SD
Fingir 8 2.35 0.37
CCI 8 1.23 0.22
CCI+FSN 8 2.46 0.72
CCI+DIEZ 8 2.26 0.97
FSN 8 2.64 0.41
DIEZ 8 2.61 0.20
FSN: Punción subcutánea de Fu;
TENS: estimulación nerviosa eléctrica transcutánea;
ICC: lesión por constricción crónica.

Tabla 3: Resumen de los valores de la respuesta electrofisiológica en picos de latencia en ratas.

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Discussion

Este estudio observa el efecto del tratamiento con FSN sobre el dolor neuropático en modelos de ICC de rata. En este estudio se presenta un protocolo de SFI y pruebas electrofisiológicas para evaluar los efectos terapéuticos después del tratamiento con FSN o TENS. Además, ilustra cómo evaluar la recuperación funcional del nervio lesionado mediante pruebas conductuales no invasivas y mediciones fisiológicas. Los resultados mostraron que el tratamiento con FSN después del dolor del nervio ciático inducido por ICC mostró una mejoría significativamente mejor en todos los indicadores pronósticos que el tratamiento con TENS. Esta investigación tiene un gran potencial para futuras aplicaciones en estudios con animales centrados en la terapia con FSN para cerrar la brecha entre la investigación básica y la aplicación clínica. Este estudio mejorará los resultados de los pacientes al comprender mejor los mecanismos de la enfermedad

La acupuntura se ha utilizado en China durante más de 3000 años y a menudo se considera un método seguro y eficaz para aliviar el dolor en humanos y animales de experimentación 34,35. Estudios clínicos previos han confirmado que la acupuntura podría aliviar el comportamiento del dolor en modelos de ICC36. La FSN, como técnica de acupuntura desarrollada a partir de la acupuntura tradicional china37, es ampliamente utilizada para el tratamiento de muchos trastornos musculoesqueléticos relacionados con el dolor38,39. A pesar de su eficacia satisfactoria en los trastornos musculoesqueléticos dolorosos, el mecanismo subyacente del tratamiento con FSN sigue sin estar claro. Las dificultades de realizar experimentos de acupuntura en animales, incluyendo la complejidad y dificultad de cuantificar las técnicas tradicionales de acupuntura y la postura incómoda del animal, pueden conducir al miedo y la resistencia a la acupuntura, dificultando la técnica de acupuntura adecuada y el posicionamiento de los puntos, aumentando el riesgo de lesiones y afectando los datos experimentales40. Investigaciones recientes en estudios con animales han arrojado luz sobre los mecanismos subyacentes a la analgesia acupuntura; La analgesia inducida por la acupuntura se asocia con la liberación de péptidos opioides endógenos41. Sin embargo, la percepción del dolor no solo se modula durante la transmisión de señales de dolor desde la periferia a la corteza, lo que indica que otros factores y mecanismos también pueden influir en la experiencia del dolor.

Con base en la hipótesis presentada por Simons et al.42,43, la formación de MTrP juega un papel clave en la sensación de dolor. Se cree que la patogénesis de la formación de puntos gatillo está relacionada con una placa terminal motora anormal dentro del músculo. La liberación excesiva de acetilcolina conduce a potenciales anormales de la placa terminal y a la formación de vendajes que pueden conducir a espasmos musculares persistentes que resultan en isquemia local e hipoxia que conduce a hiperalgesia y dolor anormal44,45. Un modelo animal para el estudio MTrP en conejos utilizando agujas secas establecido por Hong46 demuestra que la punción seca puede modular los MTrP proximales en el músculo y la médula espinal. Sin embargo, solo se discutió la relación entre la acupuntura y el músculo en este experimento, y se realizaron menos experimentos con animales en relación con la lesión nerviosa. La FSN no es lo mismo que la acupuntura tradicional o la punción seca en cuanto a técnica y base teórica. El tratamiento con FSN no actúa directamente sobre el nervio lesionado, pero es clínicamente eficaz47,48. Se demostró que en muchos trastornos neurológicos clínicos, el problema principal puede estar en el músculo más que en el nervio en sí. En este estudio, mediante la incorporación de un modelo de lesión nerviosa con ICC y el tratamiento de los músculos alrededor del nervio ciático con FSN, la terapia con FSN mostró una reducción significativa del dolor neuropático y promovió la recuperación del nervio y el músculo lesionados.

Un enfoque adicional de este experimento son los beneficios del tratamiento con FSN sin anestesia. Un estudio previo ha demostrado que la realización de experimentos de acupuntura en ratas sin anestesia puede cambiar parámetros fisiológicos como la frecuencia cardíaca, la presión arterial y los niveles hormonales debido al estrés de inmovilización49. Sin embargo, algunos investigadores han argumentado que los beneficios de realizar experimentos de acupuntura sin anestesia superan los efectos potenciales del estrés de inmovilización, incluso contrarrestan los efectos del estrés de inmovilización50. Debido al pequeño tamaño de los roedores y su sensibilidad diferencial a los anestésicos y analgésicos, además de la pérdida de conciencia causada por la anestesia general, los animales no pueden percibir el dolor. Sin embargo, en los animales inconscientes, los estímulos dolorosos todavía se transmiten y procesan a través del sistema nervioso central51. Además del pequeño tamaño de los animales roedores y su sensibilidad diferencial a los anestésicos y analgésicos, en los animales inconscientes, los estímulos dolorosos todavía se transmiten y procesan a través del sistema nervioso central. El uso de antagonistas de los receptores opioides μ y δ en animales tratados bajo anestesia puede incluso provocar la reversión de la eficacia de la acupuntura40,52.

Se seleccionó el TENS como grupo control para este estudio. El TENS es un tratamiento analgésico que utiliza corrientes eléctricas pulsadas de baja frecuencia transmitidas a través de la piel a través de electrodos sin el uso de medicación53. Se observó que la TENS de baja frecuencia fue más efectiva que la TENS de alta frecuencia en el aumento de la respuesta vascular y puede ser un tratamiento potencial para el dolor neuropático causado por CCI54. La acupuntura es eficaz para afecciones como el dolor neuropático. Sin embargo, los resultados pueden variar considerablemente en función del punto de acupuntura elegido55, mientras que la TENS reduce la hipersensibilidad nociceptiva mediante la activación de vías inhibitorias centrales con baja variabilidad en la selección de diferentes localizaciones56.

Aunque los resultados de este estudio son alentadores, se deben tener en cuenta algunas limitaciones del estudio. De acuerdo con la guía del Dr. Fu, un método completo de tratamiento de FSN debe incluir el movimiento de balanceo (tratamiento pasivo) y la técnica de reperfusión (tratamiento activo). Sin embargo, este experimento solo tiene un movimiento de balanceo; Es necesario diseñar un mejor experimento con animales en el futuro. Ensayos estandarizados previos han establecido que la evaluación de modelos animales de compresión nerviosa requiere la integración de múltiples indicadores que incluyen análisis conductual, electromiografía, inmunohistoquímica y evaluación morfológica57. En nuestro estudio, utilizamos principalmente el análisis conductual y la electromiografía para evaluar la eficacia de la terapia con FSN. Sin embargo, debido a la importancia potencial de la inmunohistoquímica y la evaluación morfológica en este contexto, reconocemos la necesidad de priorizar estos componentes en futuros ensayos de seguimiento para validar mejor la efectividad de la terapia con FSN en la mejora de este tipo de enfermedad.

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Disclosures

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Este estudio fue financiado por una subvención del centro de animales del Chang Bing Show Chwan Memorial Hospital, Changhua, Taiwán. Los autores desean agradecer al Show Chwan Memorial Hospital IRCAD TAIWAN por su inestimable apoyo y asistencia a lo largo de este proyecto de investigación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps World Precision Instruments 14098
Fu’s subcutaneous needling Nanjing Paifu Medical Science and Technology Co.  FSN needles are designed for single use. The FSN needle is made up of three parts: a solid steel needle core (bottom), a soft casing pipe (middle), and a protecting sheath (top).
Medelec Synergy electromyography Oxford Instrument Medical Ltd. 034W003  Electromyogram (EMG) are used to help in the diagnosis and management of disorders such as neuropathies. Contains a portable two-channel electromyography/nerve conduction velocity system.
Normal saline (0.9%) 20 mL Taiwan Biotech Co.,Ltd. 4711916010323 Lot: 1TKB2022
POLYSORB 4-0 VIOLET 30" CV-25 UNITED STATES SURGICAL, A DIVISION OF TYCO HEALTHC GL-181
Retractor COOPERSURGICAL, INC.(USA) 3311-8G
Rompun Elanco Animal Health Korea Co. Ltd. 27668
SCISSORS CVD 90MM BBRUAN XG-LBB-BC101R
Transcutaneous Electrical Nerve Stimulation Well-Life Healthcare Co. Model Number 2205A Digital unit which offers TENS. Supplied complete with patient leads, self-adhesive electrodes, 3 AAA batteries and instructions in a soft carry bag. Interval ON time 1–30 s. Interval OFF time 1–30 s.
Zoletil  VIRRBAC 8V8HA

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Eficacia de la punción subcutánea de Fu en el dolor del nervio ciático: cambios conductuales y electrofisiológicos en un modelo de rata con lesión por constricción crónica
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Chiu, P. E., Fu, Z., Lai, D. W., Chou, L. W. Efficacy of Fu's Subcutaneous Needling on Sciatic Nerve Pain: Behavioral and Electrophysiological Changes in a Chronic Constriction Injury Rat Model. J. Vis. Exp. (196), e65406, doi:10.3791/65406 (2023).

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